山东大学闫震团队ACS ES&T Eng.：利用工程硒纳米颗粒升级光生物制氢
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英文原题： Escalating photobiological hydrogen production using engineered selenium nanoparticles
通讯作者 ：闫震, 山东大学
作者 ：Siyuan Li, Yaxin Luo, Jiazhe Chen, Zhirui Shi, Chuyan Tang, Yameng Zhao, Jianming Yang, Zhen Yan
近日，山东大学环境科学与工程学院闫震教授团队开发了一种利用工程硒纳米颗粒逐步升级光合细菌光发酵制氢的技术。纳米硒被光合细菌内化后参与胞内电子的传递与光发酵制氢过程，显著提升了氢气产量与产率，为可持续的生物制氢提供了一种经济有效的新策略。
氢(H 2 )是一种很有前途的能源，由于其高能量密度、无污染和广泛可用性，已被提出作为化石燃料的潜在替代品。然而，传统的物理化学技术生产H 2 伴随着高能耗，是一个昂贵的过程，而生物合成H 2 被认为是一种可持续的和具有成本效益的方法。H 2 的生物生产可分为三种不同的类型：生物光解、光发酵和暗发酵，它们由不同的光合微生物和发酵微生物进行。氢化酶或固氮酶可以通过水的光解作用或有机化合物的氧化作用产生的电子还原质子进而生成H 2 。目前提高生物H 2 产量的生物技术主要是通过优化预处理工艺、工艺参数来提高底物利用率，以及应用合成生物学技术来设计H 2 生成途径。尽管这些方法很有效，但往往需要大量的时间和密集的劳动，从而提高了生产成本。最近，将合成纳米材料与生物系统整合在一起的纳米生物杂交技术已经成为一种有前途的纳米生物技术，可以增强生物功能，包括生物H 2 的生产。
为了解决上述问题， 山东大学环境科学与工程学院闫震 教授团队开发了一种利用工程纳米硒逐步升级光合细菌光发酵制氢的技术。用DLS和SEM对生物制备的SeNPs进行了表征，粒径在140-220 nm范围内（图1b和1d）。SEM显示，SeNPs具有球形形貌（图1a）。EDX能谱分析表明，样品含有两种主要元素，硒（77.21%）和硅（22.29%），其中硅信号归因于安装在样品上的硅桩（图1c）。值得注意的是，碳、氧和氮的元素组成分别约为0.10%、0.09%和0.31%，这表明用生物制备的SeNPs包覆的生物大分子的数量明显低于之前报道的生物制备的SeNPs。
图1. SeNPs的表征
用不同浓度的SeNPs进行光异养培养。添加0.1 mg/L SeNPs可促进沼泽红假单胞杆菌生长，而添加0.25至1 mg/L的SeNPs在第0天至第9天抑制了其生长（图2a）。第9天积累的细胞蛋白的定量也支持了这一观察结果（图2b）。这些结果与先前报道的在农业中使用SeNPs作为肥料的结果一致，即较低浓度的SeNPs促进了生物生长，而较高浓度的SeNPs抑制了生物生长。对添加的SeNPs的分布的检查显示，大于90%的Se定位于细胞内，当添加0.1或0.25 mg/L的SeNPs时，75%的Se以SeNPs的形式存在，通过透射电镜证实了SeNPs的内化。研究了不同浓度的SeNPs对沼泽红假单胞杆菌生长过程中H 2 产量的影响。添加0.1 mg/L SeNPs 可使其培养阶段（第8天）的H 2 产量提高7.34%（图2c）。相反，大于0.1 mg/L的SeNPs抑制H 2 的产生。细胞内NADH（还原质子生成H 2 的初始电子供体）的定量显示，添加0.1 mg/L SeNPs的培养中NADH的丰度显著高于未添加SeNPs的培养。
图2. SeNPs对沼泽红假单胞杆菌生长与产氢的影响
SeNPs倾向于在水溶液中聚集，人们已经做出了相当大的努力来提高其稳定性，并使用生物大分子进行修饰。因此，本研究中生物制备的SeNPs分别负载壳聚糖和维生素E，分别生成Ch-SeNPs和Ve-SeNPs 偶联物。FTIR用于表征SeNPs的表面基团，在III区表现出拉伸振动，表明蛋白质与这些SeNPs紧密结合（图3a和3b）。然而，壳聚糖修饰SeNPs在Ⅰ和Ⅱ区产生了较强的红外吸收带，表明壳聚糖通过氢键与SeNPs偶联。用维生素E修饰SeNPs在Ⅳ区域产生强烈的拉伸振动（图3a-b），表明维生素E通过氢和碳氧键与SeNPs结合。然后我们用DLS测量未修饰和修饰的SeNPs的zeta电位，评估它们的稳定性，与未修饰的SeNPs相比，Ch-SeNPs和Ve-SeNPs显示出更多负的zeta电位值（图3c），表明修饰SeNPs阻止了SeNPs的聚集，提高了稳定性。
图3. 修饰SeNPs的表征
通过添加不同浓度的修饰SeNPs，研究了修饰SeNPs对沼泽红假单胞杆菌生长的影响。添加0.1 ~ 0.25 mg/L Ch-SeNPs和0.1 mg/L Ve-SeNPs第0天至第9天可促进沼泽红假单胞杆菌的生长（图4a和4b）。此外，添加0.1 ~ 0.25 mg/L Ch-SeNPs和Ve-SeNPs显著提高了沼泽红假单胞杆菌的H 2 产量。在第9天观察到的最大增强效率分别为20.48%和34.43%（图4c和4d）。仅添加0.1% (w/v) 壳聚糖或0.1% (v/v)维生素E对沼泽红假单胞杆菌的生长和H 2 产量没有影响。以往的研究表明，氮饥饿条件下的非生长细胞具有较高的H 2 产量。研究表明，非生长细胞将其代谢从乙醛酸循环转变为三羧酸循环，使细胞能够充分氧化乙酸并产生更多的H 2 。因此，我们试图通过使用SeNPs和修饰形式进一步提高未生长的沼泽红假单胞杆菌的H 2 产量。当浓度为0.1-0.25 mg/L的SeNPs、Ch-SeNPs和Ve-SeNPs处理后，沼泽红假单胞杆菌的H 2 产量增加，在第14天分别达到11.93%、66.42%和77.94%的最大增加效率（图5）。
图4. 修饰SeNPs对生长沼泽红假单胞杆菌产氢量的影响
图5. 修饰SeNPs对非生长沼泽红假单胞杆菌产氢量的影响
虽然纳米颗粒的使用已被广泛研究，以提高生物H 2 的产量，但本研究发现，SeNPs及其修饰形式即使在低浓度下也特别有效。本研究结果表明，添加0.1 mg/L的SeNPs使生长中的沼泽红假单胞杆菌H 2 产量增加了7.34%，添加0.1 mg/L修饰的SeNPs使生长中的沼泽红假单胞杆菌和未生长的沼泽红假单胞杆菌H 2 产量分别增加了34.43%和77.94%。
H 2 产率的评估是一个关键参数，因为它可以准确地评估H 2 生产过程的效率。与对照相比，添加0.1 ~ 0.25 mg/L Ch-SeNPs和Ve-SeNPs显著提高了未生长的沼泽红假单胞杆菌的乙酸消耗量。由于所有消耗的乙酸被认为用于未生长的沼泽红假单胞杆菌产氢，因此添加0.1 mg/L Ch-SeNPs和Ve-SeNPs的H 2 产率分别计算为1.06和1.08 mol/mol乙酸。在暗发酵和光发酵过程中，H 2 的生产效率或产量取决于生物的类型和所使用的原料。在混合或纯微生物中，通过暗发酵或光发酵过程，葡萄糖的最佳利用率可产生1-2 mol的最大H 2 产率，而添加各种类型的金属基纳米颗粒可促进这一过程。考虑到1mol葡萄糖产生的NADH几乎是氧化1mol乙酸的三倍，我们在这里开发的SeNPs增强光生物制氢的效率比以前报道的纳米粒子制氢的效率更高。此外，乙酸（300-450美元/吨）是葡萄糖（500美元/吨）的廉价替代品，到2020年，乙酸的需求量将超过183.48亿吨。因此，采用低成本的乙酸作为碳源，光发酵制氢的经济可行性可提高50%。
在沼泽红假单胞杆菌制氢中使用SeNPs的潜在限制必须考虑添加浓度为0.5 mg/L或更高的SeNPs或修饰形式抑制生长细胞和非生长细胞的H 2 生成（图2c, 4c和4d）。细胞内化纳米颗粒引起的氧化应激是抑制微生物生理生长的一种公认的机制，因此通过监测细胞内 ROS的丰度来评估SeNPs和修饰SeNPs的毒性。在培养物中添加SeNPs后，ROS的生成增加。这与之前的报告结果一致，即内化纳米颗粒诱导氧化应激。此外，GSH过氧化物酶的活性中心需要硒，该酶催化GSH氧化为谷胱甘肽二硫化物以清除ROS，因此评估了细胞内GSH的丰度。添加的SeNPs或修饰的SeNPs浓度的增加会导致GSH丰度的降低，表明抗氧化活性增强。然而，在0.5 mg/L和1 mg/L的浓度下，添加修饰SeNPs或修饰SeNPs，细胞内ROS丰度显著增加，表明沼泽红假单胞杆菌抗氧化系统不能耐受SeNPs引起的氧化应激。
为了研究SeNPs增强沼泽红假单胞杆菌 H 2 生成的机制，我们试图鉴定与SeNPs结合的细胞内蛋白。以0.1 mg/L的浓度在沼泽红假单胞杆菌生长过程中进行修饰，从沼泽红假单胞杆菌原生质体中分离出未经修饰的SeNPs，采用与制备原始SeNPs相同的方法纯化。SDS-PAGE显示，在从沼泽红假单胞杆菌中纯化的内化SeNPs中可以看到大量的蛋白质条带，而在产生H 2 的实验中未使用的原始SeNPs或未添加 SeNPs的培养纯化产物中，蛋白质条带不可见或太轻而无法识别。LC-MS/MS分析共鉴定出150种与沼泽红假单胞杆菌结合的蛋白，根据其注释的功能分为9类，包括生物合成、代谢途径、铁硫结合、光合作用、氧化反应、信号转导、膜结合、转录和翻译等。在鉴定的150个蛋白质中，有20个可以参与产生H 2 的电子传递链。图6显示了沼泽红假单胞杆菌生产H 2 的电子传递。NADH作为电子供体参与循环光合磷酸化，涉及到泛醌和细胞色素c相关的氧化还原酶，产生还原的铁氧还蛋白和ATP，然后作为底物为钼型氮酶生产H 2 。从SeNPs结合蛋白中鉴定出参与循环光合磷酸化的蛋白，如光收集蛋白、细胞色素c和ATP合成酶，以及参与H 2 生成的蛋白，如铁氧还蛋白和钼型氮酶。因此，我们推测内化的SeNPs作为半导体纳米粒子促进了电子传递链，从而提高了H 2 的产生。
图6. SeNPs介导的沼泽红假单胞杆菌产氢的机制研究
这一假设得到了先前对纳米颗粒介导的生物H 2 生成增强机制研究的支持。有趣的是，主要产生NADH的TCA循环中一些酶从SeNPs结合蛋白中鉴定出。考虑到添加0.1 mg/L SeNPs可使NADH丰度增加（图2），内化的SeNPs可能有助于产生NADH的氧化还原过程。内化的SeNPs如何与TCA循环中涉及的NADH产生的关键酶相互作用需要进一步探索。
综上所述，本研究探讨了SeNPs对沼泽红假单胞杆菌生长和产氢的影响。SeNPs被内化，随后参与能量代谢和胞内电子向H 2 生成转移。在未生长的沼泽红假单胞杆菌中添加0.1 mg/L经维生素E修饰的SeNPs，H 2 效率最高（77.94%），H 2 产率为 （1.08 mol H 2 /mol乙酸），为可持续的生物制氢提供了一种经济有效的方法。
相关论文发表在 ACS ES&T Engineering 上，山东大学硕士研究生李思瑗为文章的第一作者，山东大学闫震教授为通讯作者。
通讯作者简介：
闫震 教授
山东大学环境科学与工程学院教授，泰山学者青年专家、山东省优青、山东大学齐鲁青年学者。主要从事环境微生物生理与生态、面向碳中和战略的环境生物技术开发等领域研究。近年来以第一或通讯作者在 PNAS, Nature Commun, ISME J, mBio, ACS EST Engg/Water, Biotech Biofuels, Environ Sci: Nano, Microb Ecol, Mol Micro 等高水平杂志发表文章。
来源： ACS美国化学会 。 投稿、合作 、转载、进群，请添加小编微信Environmentor2020！环境人Environmentor是环境领 域 最大的学术公号 ，拥有 20W+活跃读者 。由于微 信修改了推送规则，请大家将环境人Environmentor加为 星标 ，或每次看完后点击页面下端的 “赏” ，这样可以第一时间收到我们每日的推文！ 环境人Environmentor现有综合群、 期刊投稿群、基金申请群、留学申请群、各研究领域群等共20余个，欢迎大家加小编微信Environmentor2020，我们会尽快拉您进入对应的群。
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