西安电子科技大学邓宏章PNAS：非离子mRNA递送系统

第一作者：王长荣，赵彩艳，王伟鹏

通讯作者：邓宏章

通讯作者单位：西安电子科技大学生命科学技术学院

https://doi.org/10.1073/pnas.2311276120

一、文章简介

目前，传统基因递送系统均需使用大量可电离/阳离子载体通过静电作用与负电性基因（siRNA、DNA以及mRNA）形成复合物来实现对基因的保护与递送。然而，传统可电离/阳离子递送载体存在以下固有不足：高毒性、高体内炎症反应以及细胞胞吐效应。在众多现行传统基因递送系统中，核心思想仍旧是构建可电离/阳离子递送系统通过静电作用来复合基因。如此，通过静电作用复合来负载保护基因，可电离/阳离子是必不可少的，可电离/阳离子载体的固有不足也是无法逾越的一道障碍。为此，针对以上基因递送系统所存在的问题，以mRNA递送为例，该课题组另辟蹊径，摒弃传统静电作用负载mRNA。依托西安电子科技大学信息技术与人工智能优势背景，以医工交叉研究为导向，邓宏章教团队在前期研究中，通过对海量功能基团进行人工智能模拟训练，最终筛选出可以通过非离子力与mRNA结合的基团，即为硫脲基团。该团队通过引入电中性硫脲基团构建非离子递送系统，利用其与mRNA磷酸主链强的氢键作用来形成复合物实现基因的递送与保护。结果表明，构建的非离子型递送系统在血清存在下仍然保持较高的转染效率，较低的体内毒性与炎症响应。与传统的可电离/阳离子递送系统相比，非离子型递送系统mRNA体内表达周期可以延长7倍左右。另外，该团队也意外的发现非离子型递送系统具有较好的脾脏靶向能力。

二、图文导读

为了摒弃传统的静电作用负载基因的模式，该团队研究开发了一种T-型无阳离子脂质纳米粒 (NC-TNP)，主要通过硫脲端头与基因的磷酸基团形成强的氢键作用，进而实现mRNA的有效负载 (图1)。首先，作者将硫脲基团作为氢键供体与不同长度的碳链 (C6，C12，C18) 共价连接，合成了一系列的T-型非离型脂质，并通过微流控技术制备了包载基因的NC-TNP纳米粒，证明了NC-TNP能够成功通过氢键作用负载mRNA、pDNA和siRNA。随后，作者选取经典的静电作用负载基因的载体LNP为对照，以mRNA为目的基因，考察了NC-TNP的基因转染效率，NC-TNP/mRNA的转染效率在无血清和有血清的条件下均优于传统的LNP/mRNA。并且，作者进一步考察了NC-TNP/mRNA的生物活性长期稳定性，结果证明不管是纳米粒水溶液还是冻干粉形式，NC-TNP/mRNA仍能保持mRNA的生物活性。同时，作者发现疏水链为C18的NC-TNP表现出更高的生物稳定性，为后续选用疏水链为C18的NC-TNP作为mRNA递送载提供了依据。

图1. 非离子基因递送系统的结构与基因复合物的制备

随后，作者进一步揭示了非离子递送载体NC-TNP的胞内递送机理，并分别从胞吞和外排对该递送系统进行示踪 (图 2)。从胞吞途径来看，在前4小时内，经典的静电负载基因载体LNP主要是通过网格蛋白介导的胞吞方式进入细胞，而NC-TNP则主要是通过微胞饮介导的胞吞方式进入细胞。24小时后，NC-TNP与LNP没有表现出明显差异，都是通过微胞饮介导的胞吞途径进入细胞。研究结果发现有部分LNP/mRNA通过内吞循环介导的途径被排出胞外，而NC-TNP/mRNA几乎没有通过这种方式被排出胞外。并且，在逃逸过程中，由于NC-TNP的硫脲基团可以和膜磷脂氢键相互作用，增强了膜透化作用和不稳定性，从而促进内涵体逃逸，同时发现NC-TNP/mRNA在逃逸过程中仍能保持完整的纳米粒形态，更有效地防止了mRNA被降解。

图2. TC-TNP/mRNA胞吞和胞内运输机理

通过皮下给药、肌肉给药和静脉给药三种方式，作者分别考察了NC-TNP的体内炎症反应与毒副作用。与传统静电负载基因载体相比，NC-TNP没有引起明显的红色肿块、CD45 ⁺ 白细胞的浸润、与空白组无异的炎症因子水平(GM-CSF，IL-1β和IL-6)、无明显的心肌细胞凋亡。为证明该递送载体结构的优势，作者合成了与该结构相似的阳离子和可电离载体，进一步证明了NC-TNP的低炎症相关副作用和细胞毒性。

基于上述非离子NP-TNP递送系统高的体外转染效率和生物安全性，作者考察了NC-TNP体内基因递送效率。首先，通过皮下给药方式，证明了NC-TNP/mRNA有持久的荧光素酶表达时间，长达20天，是经典静电相互作用负载基因载体LNP的7倍，说明NC-TNP能保护mRNA，防止体内的降解，进而增强体内mRNA转染效率。淋巴结作为引起免疫反应的部位，作者探究了淋巴结内mRNA的递送效率，其中NC-TNP/mRNA处理处理后有超过14%的DC细胞表达Cre蛋白，优于LNP。随后，作者通过Cy5分别标记NC-TNP和LNP，通过静脉给药方式注入小鼠体内，经活体成像系统 (IVIS) 发现NC-TNP组主要富集在脾脏，而LNP组主要富集在肝脏，并且，NC-TNP在脾脏没有明显的毒副作用。这些结果表明NC-TNP有靶向脾脏而不是肝脏的能力。脾脏作为人体的第二大免疫器官，可以很好的引发体内免疫反应。最后，作者选取表达OVA蛋白的mRNA为目的基因，验证了长期免疫反应，证明了NC-TNP/mRNA能有效引起体内免疫，并且形成长效的免疫记忆。

该工作以“ Biomimetic noncationic lipid nanoparticles for mRNA delivery ”为题发表在 《PNAS》 上( Proceedings of the National Academy of Sciences , 2023, 10.1073/pnas.2311276120 )。文章第一作者为西安电子科技大学 王长荣 博士， 赵彩艳 博士， 王伟鹏 在读研究生，通讯作者为西安电子科技大学生命科学技术学院 邓宏章 教授。

三、小结与致敬

这项工作是基于非离子脂质为载体，通过强的氢键作用实现了mRNA的有效递送。通过该方式可以保证载基因纳米粒的完整性，规避因mRNA泄露与外排造成的mRNA损失问题，同时避免了传统阳离子基因载体造成的体内炎症反应与毒副作用。如此有效的递送载体展现出了优异的脾脏靶向效果，并有效引起体内免疫与免疫记忆。为许多疾病的免疫治疗提供了有效的递送系统和概念性证明。

该研究工作得到了国家自然科学基金 (32171320, 81371667, 82302384和 32201173)、西安市科协青年人才促进计划 (095920221341)、陕西省自然科学基金 (2023-JC-YB-196)、秦创园高层次创新创业人才计划 (QCYRCXM-2022-27和QCYRCXM-2022-232)、广州市科技项目 (2023A04J1510) 和中央高校基本科研业务费 (QTZX23058) 等项目资助。

四、通讯作者介绍

邓宏章于2018年于天津大学获得博士学位，随后去往美国国立卫生研究院进行博士后研究，2021年加入西安电子科技大学，任教授、博士生导师。邓宏章教授团队多年来一直从事机器学习辅助构建纳米递送系统相关方面的研究，依托西安电子科技大学信息技术与人工智能优势学科背景，来解决生命科学与医工交叉领域中的科学问题。在国际知名期刊发表了系列重要研究成果，包括：PNAS, Nat. Commun.，Matter，Adv. Mater.，Adv. Funct. Mater.，Nano Today，Nano Lett.等。