科研 | Nature子刊（IF：17.745）：拟南芥叶际微生物对病原菌的抵御作用

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编译：微科盟小兵 ，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

植物的地上部分是细菌群落的宿主。叶际核心微生物群落可以保护拟南芥免受病原菌的侵袭。然而，叶际微生物对植物的保护作用是否普遍存在、保护方式存在多少差异尚不清楚。本文系统分析了 At -LSPHERE菌株对植物的保护作用， At -LSPHERE是从拟南芥植物中分离出的200多株能抵御细菌病原菌 Pseudomonas syringae  pv. tomato DC3000的细菌集合。在无菌环境中，对总共224株细菌的植物保护功能单独进行评估。 这些菌株对病原菌的抵御效果各不相同，约10%的叶际微生物菌株可以提供完全保护，约10%表现出中等水平的保护程度，其余约80%没有明显降低疾病感染风险。 保护效果最好的菌株分布在不同的分类单元。 合成群落实验揭示了菌株的累加效应，同时也发现单菌株在群落环境中可以充分发挥保护作用。 我们找出了叶际微生物植物保护作用的不同机制，尽管一组菌株触发模式的免疫辅助受体信号参与了对植物的保护，但在功能性免疫受体BAK1和BKK1缺失植株中的菌株也能对植物起保护作用。利用比较基因组学方法并结合诱变技术，我们揭示了细菌-病原体的直接相互作用，这有助于 利用 Rhizobium  Leaf202保护植物免受病原菌的侵袭。 这表明，这种基于提供数据的计算方法可以用于鉴定对植物保护至关重要的微生物基因 。

论文ID

原 名： Protective role of the Arabidopsis  leaf microbiota against a bacterial pathogen

译 名 ： 拟南芥叶际微生物对病原菌的抵御作用

期刊 ： Nature Microbiology

IF： 17.745

发表时间： 2021.11.24

通讯作 者： Julia A. Vorholt

通讯作者单位： 苏黎世联邦理工学院

DOI号： 10.1038/s41564-021-00997-7

试验设计

结果

1. 植物保护潜力的三方筛选试验

为了揭示微生物群落如何作用于宿主表型，在这种情况下，我们系统评估了具有广泛代表性的微生物的植物保护作用，定植的影响。我们测试了224株拟南芥叶际菌株（统称为 At -LSPHERE菌株集）的植物保护潜力。对自然环境下的拟南芥植物进行16S核糖体DNA测序，以97%相似度聚类OTUs，我们发现这个菌株集的多样性占所观察到的多样性的50%。此外， 无菌环境下，这些菌株在门水平上的装配类似于自然环境下的微生物群落 。我们采用1个3部分拟南芥模型系统，从植物中筛选出能抵御 luxCDABE 标记的 P. syringae  DC3000（Pst）的菌株。从两方面评估保护效果，即根据病原菌的荧光强度和之前建立的疾病表型评分（图1）。我们分批进行筛选，每一批都包括阳性对照（ Sphingomonas   melonis  Fr1）和阴性对照（空白接种）。对部分菌株进行了独立试验，证实试验的稳定性普遍较高（附图1）。

 

图1 试验筛选系统概况。 拟南芥种子经表面灭菌后，在24孔板琼脂上生长。10天后用共生菌株的悬浮液接种叶片来进行保护能力测试，菌株留在植株上定植。15天后用 lux 标记的假单胞菌DC300（Pst）侵染植株。以两种方式根据有无病原菌感染进行评分。荧光定量用于代表病原菌定植程度。基于症状的疾病评分，并根据对照植物的症状，计算保护得分。此外，我们利用未感染植株，清洗后通过对c.f.u.计数去确定共生菌株在叶际的定植程度。

 

图2  At -LSPHERE菌株对植物的保护效果概述。 单菌株保护植株免遭 lux 标记的假单胞菌DC3000侵袭的作用。 At -LSPHERE的细菌菌株与阳性对照 S. melonis Fr1的系统发育树，其背景颜色与门、纲对应。内环（灰色范围）表示接种9天后每克植物鲜重经过log ₁₀ 转化后的c.f.u.。第二个环（蓝色范围）表示感染6天后荧光强度降低，也就是病原菌定植减少。外环（绿色范围）反映保护程度（对疾病的防护），条码的高度和颜色都对应平均保护得分。背景中的同心圆分别表示平均保护得分为50-75、75-90和90-100。星号表示该菌株未对植株提供保护（方法）。系统发育树基于全基因组序列。

 

总的来说，根据病害严重程度， At -LSPHERE菌株保护植物免遭Pst侵害的效果可以划分出一个范围，从没有保护到完全保护。在测试的224株菌株中，18（8%）株提供了完全保护，大多数感染植株表现出与未感染植株相似的表型，平均保护得分大于90（图2，附表1），这些菌株大部分属于变形菌门中的假单胞菌属、根瘤菌属、鞘氨单胞菌属、伯克霍尔德菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属和不动杆菌属。其他一部分保护作用较好的菌株属于放线菌门的节杆菌属和短杆菌属。除了根据病害症状严重程度进行评分，我们还利用荧光强度作为病原菌定植密度的指标。与这些菌株的高保护得分一致的是， 感染前接种这些菌株的植物的荧光强度明显低于对照植物，这表明他们成功地减少了病原体的定植密度 （图2，附表1和2）。另外10株菌株平均保护得分大于75。此外，这些菌株大大减弱了病害症状，使大多数植物在实验过程中几乎没有病害症状的情况下生存，但也有植物表现出轻微的病害症状。对其中5株菌株进行测试，发现其感染滴度高出100倍和1000倍，这一结果证实了上面的结果。高保护得分的菌株在较高的感染滴度下依然具有保护作用， 而保护得分在75左右的菌株在高感染滴度下保护效果稍差，但比对照组菌株仍具有更好的保护效果 （拓展数据图1，附表3）。使用平均保护评分为50的临界值，总共43株菌株表现出中度或更强的保护作用（附表1），然而大多数菌株确实没有保护作用或者仅仅略微改善了染病植株的疾病症状（图3）。

 

图3 以高密度在叶际定植的 At -LSPHERE中的具有保护作用的菌株。 a，b， At -LSPHERE菌株平均保护得分（n=222株）（a）和平均定植密度（n=224株）（b）的直方图。c，平均定植密度（以log ₁₀ 转化）与平均保护得分的相关性（Pearson’s R = 0.47， t = 7.97，d.f. = 223， P = 8 × 10 ^-14 ）。线性回归线已标出。虚线框表示平均定植密度大于10 ⁵ c.f.u.mg ^-1 平均保护得分大于75。d，分别对每个科的平均保护得分绘制平均定植图。图中颜色对应门和纲。a.u.是吸光度单位。补充表1和补充表2分别提供了每个菌株独立试验和重复试验的确切次数，基于疾病症状评分的保护程度与荧光减少量密切相关（ R =0.93， t =368，d.f.=220， P <2.2×10 ^-16 ），高密度定植的病原菌造成一致的疾病症状（补充数据1）。然而，一些菌株因为自身原因影响了植物的表型，或者改变了假单胞菌属染病结果（补充说明，附图2）。两株菌株（Leaf75和Leaf50）的症状是由于自身原因，不是Pst感染的影响，因此没有进行保护评分（附图2b和d）。荧光检测表明沙雷氏菌属Leaf50减少了Pst的定植（附表2），但即使在较低的接种滴度，由于其自身也表现出病害症状（附图2c）。这一观察结果值得注意，因为所有 At -LSPHERE菌株都是从在环境条件下生长的健康拟南芥植物中分离出来的，这表明单个菌株的保护作用在自然群落环境中受到限制。

 

2.  At -LSPHERE株系保护植物与系统发育和定植的相关性

接下来，我们从系统发育分布和植物定植的角度考察了微生物群落对植物的保护作用。保护性和非保护性菌株在 At -LSPHERE系统发育树上的分布揭示了保护性菌株集群的存在（图2）。确实，我们在植物保护性状中发现了一个明显的系统发育信号（Pagel’s λ=0.979， P =1×10 ^-45 ，Abouheif’s C _mean =0.569， P =0.001），该信号在二次抽样时也很稳定（附图3），这表明 近缘菌株比两个水机挑选的菌株更有可能具有相似的保护表型。

我们以群落形成单元（c.f.u.）测定了 At -LSPHER菌株的叶际定植水平。大多数菌株的密度大于10 ⁴ c.f.u.mg ^-1 ，大多数定植密度在10 ⁴ -10 ⁶  c.f.u.mg ^-1 （图3 b 和c，附表1和2）。肠杆菌科、假单胞杆菌科、诺卡氏菌科、微杆菌科的菌株定植密度最高（图3d）。少数菌株不是没有就是只是零星在叶际环境存在（补充数据1）。

综合叶际定植能力和保护作用评分结果，表明 当考虑所有菌株时，两个特性均呈正相关 （log ₁₀ Spearman’s相关系数（c.f.u.mg ^-1 ）和保护得分， R =0.47， t =7.97，d.f=223， P =8×10 ^-14 ；Spearman’s ρ=0.49， P =9.8×10 ^-15 ；图3c）。保护得分大于75的菌株也是具有较好地定植能力，定植密度大于10 ⁵ c.f.u.mg ^-1 。然而事实并非如此，许多表现出较高定植能力的菌株却不能保护植物。值得注意的是， 平均定植率与平均保护得分之间的相关性在不同类群中并不均匀分布 （图3d）。例如，大多数测试的假单胞菌表现出完全保护作用，一株（Leaf48）表现出弱化的保护作用，一株（Leaf83）没有表现出保护作用。保护作用的差异与定植密度的差异有关（ R =0.98， t =13.328，d.f=7， P =3×10 ^-6 ）。在我们的实验中，Leaf83是唯一的没有在拟南芥叶际环境中重复定植的假单胞菌属（附表2）。相反，对于甲基杆菌科，大多数菌株有较好地定植能力（大于10 ⁵ c.f.u.mg ^-1 ），但没有菌株具有保护作用。对于鞘氨醇单胞菌科和根瘤菌科，定植能力最佳的菌株同时具有最高的保护作用，然而值得注意的是，同科的其他细菌没有保护作用。

  图4 SynComs实验揭示具体群落的保护效果。 在使用lux标记的假单胞杆菌（Pst）感染前5天，将10株没有保护作用的菌株随机接种在拟南芥植株上，并在感染后13天对疾病症状进行评分（dpi）。a，随机SynComs的保护得分与组合中最佳单菌株的平均保护得分。在单独实验中对去除特别菌株的混合组合进行了标记。b，5个随机SynComs的所表明菌株的去除以及各SynComs对保护作用的影响。箭头表示从完整群落到剔除所表明菌株群落保护效果的变化。用随机SynComs M10.35、没有Leaf278的SynComs M10.35、Leaf278单菌株和缓冲液（Ax）接种植株。接种5天后，用Pst侵染植株。疾病评分从1（健康）到5（死亡）的分布如c所示，13 dpi处的代表性图像如d所示。e，6 dpi是病原菌荧光强度箱线图（每种条件下n=18-24株）。箱线图中线，中位数；框限，上下四分位数；虚线，1.5×四分位距；点，离散值。f，分别用M10.35、M10.35-278、Leaf278或者缓冲液接种植物，12天后确定定植情况。图中显示的是分别代表两株植株的四个重复数据的中位数和各重复的数据点。字母表示基于单因素方差分析和Tukey事后检验具有显著差异。 P 值和重复次数见附表7。

 

与植株保护作用相同，在植株的定植中也发现了一个系统发育信号（Abouheif’s C _mean =0.41， P =0.001，Pagel’s λ=0.988， P =5×10 ^-26 ，附图3）。因此，尽管定植特征和保护作用都因菌株而异，但是近缘菌株趋于表现出相似的植物特征。

 

3. 合成群落的保护作用测试

接下来，我们测试了不同菌株组合，并研究了组合的保护效果。我们随机选10种菌株组装成群落（SynComs）进行研究（合成群落试验的更多细节见补充说明）。虽然平均保护得分小于25的菌株的SynComs没有提高保护作用（拓展数据图3和附表4），但是大多数包含平均保护得分小于65菌株的SynComs相比于其中单菌株的最佳保护效果表现出更好的保护效果（图4a，拓展数据4，附表5）。值得注意的是， 两个SynComs（M10.35和M10.21）的保护得分大于85，这相对于其最佳单菌株保护效果是一个明显的提高。 因此，我们想弄清楚更好的保护效果是否可能是由于SynComs中的一株或两株。我们去掉了个别菌株的一些组合只是失去了部分群落的保护作用。相反，对于SynComs M10.35，去掉红球菌属Leaf278和短杆菌属Leaf261这两个最丰富的菌株后，保护作用严重下降，保护得分从92变成了38（图4b，拓展数据图5，附表6）。红球菌属Leaf278在感染植株上表现出明显的胁迫和疾病表型，其荧光标记减弱，但植株表型没有明显改善（附图2和4d）。由于红球菌属Leaf278是SynCom中丰度最高的菌株，我们测试了去除Leaf278是否会破坏M10.35 mix的保护效果，确实，与接种了完整SynCom的植株相比，没有Leaf278的SynCom表现出更高的Pst定植率和更严重的病害（图4c-e）。红球菌属Leaf278和SynCom M10.35的植物定植效果相当（图4f，附表7）。因此，SynCom M10.35保护作用的提高并不是因为整体植物定植率较高，而是需要M10.35至少有两个不同的菌株，且其中一个需要是Leaf278。然而，并不是每一个含有Leaf278的菌株组合都具有较高的保护作用。我们测试了另外一个SynCom（M10.48），发现 有没有Leaf278都没有提高保护效果，完整SynCom保护效果与Leaf278单菌株效果相同 （图4b），说明Leaf278发挥作用是有条件的。因此根据该菌株及其相关菌株中存在的大量天然产物基因簇，进一步推断Leaf278增强保护作用的相互作用机制将是一项有趣的研究。

此外，我们使用较小的合成群落来评估菌株潜在的协同效应。我们假设潜在的作用或协同效应可以在较小的菌株群落中更好地识别，这些菌株本身显示出可量化但不强的保护作用。我们组装了3种菌株的SynCom，并将它们并行与单菌株测试植物保护效果。根据保护得分和荧光强度，3种混合组合中的2种（M3.1和M3.3），相对于单菌株提高了植物保护效果（拓展数据图6，附表8，更多细节见补充说明）。这些菌株单独作用都获得了中等的保护得分，因此证实了叠加效应。综上所述，这表明 多菌株联合作用可以提高保护效果，而菌株最多的M3.2组合的结果表明，群落不是越复杂保护效果越好。

 

图5 根据荧光分析，在 b ak1/bkk1 植株上一系列菌株的保护作用显著降低。 在用 lux 标记的假单胞杆菌侵染前，拟南芥Col-O和 b ak1/bkk1 植株用共生菌株或空白控制（Ax）接种五天。侵染6天后测定荧光强度。箱线图描述了中位数和四分位距，虚线延伸到1.5四分位距。菌株分组是根据 b ak1/bkk1 基因型对基于荧光强度判断的染病程度的作用。比较 b ak1/bkk1 和Col-O感染植株，展示 P 值（one-sided Welch’s test， P 值通过benjamini–Hochberg方法校正）。# ，b ak1/bkk1 的条件致病菌。图中展示的是具有保护作用的菌株（在Col-O植株上的平均保护得分大于75）和对照组（Fr1和Ax）。其他细节见附图4。数据来自1-4个独立实验，每个实验16-18株植物重复。确切的 P 值和重复试验次数分别见附表9和10。

 

4. 植物保护互补机制的证据

微生物保护植物免遭病原菌感染可归因于根本不同的机制。其中一个机制涉及植物的免疫系统和宿主的防御反应，这些反应是由某些微生物触发的。大量的特异性受体（例如LRR-RLKs）可以感知细菌，这些受体依赖于辅助受体BAK1和BKK1。我们在 b ak1/bkk1 缺失植株上测试了 At -LSPHERE所有具有保护作用的菌株以及一些表现中等保护作用（平均保护得分在50-75）或没有保护作用的菌株的保护效果损失情况。确实发现， 在 b ak1/bkk1 缺失植株中28株具有保护作用的 At -LSPHERE菌株中有9株的荧光强度和病原菌定植量都有所增加 （图5，其他菌株见附图4）。值得注意的是，在 b ak1/bkk1 缺失植株中，鞘氨醇单胞菌属Leaf205和假单胞菌属Leaf127的植物保护作用较弱，其荧光强度和病害程度均高于无菌对照组（图5，补充数据2，附表9和10），这种保护作用的丧失不能归因于 b ak1/bkk1 缺失下 At -LSPHERE菌株定植量的减少（附表10）。对于其他在 b ak1/bkk1 缺失植株上病原菌滴度较高的具有保护作用的菌株，目前尚不清楚这种结果是否仅仅是因为bak1/bkk1缺失导致更易受到病原菌侵染，因为荧光强度的增加量并不比无菌感染对照组植株多（附表9），然而它们与那些在 b ak1/bkk1 缺失植株上荧光强度较低的菌株相比又有明显的差异。值得注意的是，黄单胞菌属Leaf131和Leaf148在 b ak1/bkk1 植株上表现为条件致病菌，即使在没有Pst侵染也能杀死大量植物，这种情况在野生型植株中并不存在（附图5）。这与最近观察到的Leaf131和Leaf148是免疫受损 rbohD 植株上的条件致病菌是一致的。值得注意的是， 18株具有保护作用且平均保护得分大于90的菌株中有6株在植物未染病情况下发出荧光，因此事实上完全保护了 b ak1/bkk1 植株 。目前不能排除在保护效果最好的菌株中，植物自身的保护机制是否会强大到足以掩盖任何潜在的植物介导的过程。另外，植物也可能单单依靠BAK1/BKK1识别特定菌株的存在。重要的是，没有一株平均保护得分大于75的菌株完全丧失保护作用，这表明植物保护作用有多重机制。

 

图6 T6SS与 At -LSPHERE中的根瘤菌属的植物保护作用的关系。 a，在具有保护作用的根瘤菌中存在而在无保护作用根瘤菌中不存在的COGs的热图，对与T6SS有关的COGs进行标记。b，展示的是根瘤菌Leaf202的T6SS基因簇与 tssL 突变体基因替换。c，Leaf202和 tssL::Km ^f 突变体（ tssL::Km ^R 和 tssL::Km ^F 与aphll卡带方向相反）对添加甲醇（R2A+M）的Lb-Lennox （LB）和R2A的体外抑制作用，字母表示显著差异（遵循Tukey事后检验的单因素方差分析）。d，Leaf202及其 tssL::Km ^F 突变体在侵染7天后对Pst定植的抑制作用（n=19,18,18分别对应野生型， tssL::Km ^F 和Ax）。e，接种12天后，Leaf202及其 tssL::Km ^F 突变体在植物体内的定植情况（n=19和18，分别对应野生型和 tssL::Km ^F 和Ax）。d和e显示的是平均值和单菌株数据点，双侧Welch t 检验的 P 值。植物接种实验进行了两次，结果相似。

 

5. 比较基因组学鉴定保护性状

接下来我们想知道 At -LSPHERE菌株的基因组是否可以用于鉴定与植物保护相关的遗传特征。由于菌株具有高度的系统发育多样性，我们预测在同时含有保护作用和无保护作用菌株的属中，可能与保护作用相关的差异更容易被识别出来。作为概念证明， 我们关注的是根瘤菌，它在我们的数据集表现出一个保护程度梯度的平衡分布：具有保护作用的、中等程度的、无保护作用的菌株 （图6a）。我们鉴定出25个存在于具有保护作用菌株中但不存在于无保护作用菌株中的同源基因簇（COGs，附表11，图6a）。有趣的是，这25种同源基因簇中有14种被预测为Ⅵ型分泌系统（T6SS）基因或T6SS相关基因。在体外和植物中，T6SS在先前的研究中被指出可以通过农杆菌和假单胞菌介导细菌的相互作用。

为了验证T6SS的存在对植物保护效果是否重要，我们从根瘤菌Leaf202中获得了T6SS突变体（图6b）。体外实验表明，根瘤菌Leaf202抑制了Pst，而该抑制作用确实部分依赖于功能性T6SS（图6c）。然后我们测试了Leaf202野生型和 tssL 突变体的植物保护效果。与野生型相比， tssL 突变体有更高的Pst定植，这表明功能性T6SS确实有助于植物保护（图6d）。这与Leaf202定植密度无关，因为野生型和 tssL 突变体在叶际定植的程度相当（图6e）。总的来说， T6SS在 At -LSPHERE菌株中广泛分布，且根据总体分布，T6SS比预期存在于更多的保护作用菌株 （Fisher’s精确检验，优势比3.29，P=9×10 ^{− 4} ）。因此，T6SS可能是菌株集的植物保护作用机制之一。

讨论

植物相关微生物对于宿主表型是至关重要的，包括植物保护作用。在此，我们筛选了224株基因组测序过的菌种组成 At -LSPHERE，用于植物抵御 P. syringae  DC3000感染，从而得到系统的基因型-表型（植物保护和定植）相关数据。我们从222株能够保护拟南芥免遭Pst感染的菌株中选出28株。保护作用最强的菌株属于变形菌门和放线菌门，在厚壁菌门和拟杆菌门中均未发现保护作用菌株。我们的分析表明， At -LSPHERE对叶际病原菌的抵御显示出较弱的系统发育信号 （图2，附图3）。这表明垂直基因遗传所保护的微生物性状具有系统发育保守性，这与系统发育性状保守性普遍存在，特别是遗传复杂性状，这一观察结果一致。然而，我们也观察到特殊菌株的例子（例如假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属），这与之前观察到的植物表型复杂往往是由于菌株特异性相一致。

许多保护菌株是叶际微生物群落的一部分，可在植物叶面反复发现。虽然约10%的相对比例较低，但我们的筛选结果表明，很可能具有保护作用的菌株在叶际环境系统中存在。由于所有具有保护作用菌株以高密度定植（图3），这些菌株可能比其他菌株更具有竞争力，从而会出现保护性菌株的富集。因此， 检测具有保护作用菌株是否会在群落环境中优先富集，更具体地说，在植物胁迫下是否优先富集，将是一件有趣的事情。这种观察结果也与剂量依赖性的生物防治表型有关。 最终，在环境条件下，更高的定植密度可能是保护作用的必要条件；然而作为保护的结果，高的定植适应性也可能被选择。这就提出了一个更普遍的问题：具有保护作用菌株是否更加经常与植物相关或被植物选择。有证据表明， 植物可以聚集具有保护作用的微生物群落，吸收对自己有益的微生物或富集最有益的细菌群落。 有趣的是，在观察群落依赖性保护作用的SynCom实验中，我们注意到，在一些将最丰富菌株去除的实验中，我们确实同时排除了最具保护作用的菌株（图4）。这一观察是否适用于更复杂的群落，或者是否低丰度菌株的去除会影响保护效果还需要进一步检测。此外，测试其他病原菌，以了解在某种程度上能够抵御Pst的菌株在遇到另一种病原菌时是否还具有保护作用，这将是很有意义的。

这里使用的普遍的筛选方法可以避免在体内菌株测试前进行的体外相互作用预筛选造成的偏差。相反，在植物产生的表型可以与其他数据集结合，这些数据集现在或者在将来会成为 At -LSPHERE参考资料。 At -LSPHERE菌株收集之前已经在体外进行了拮抗相互作用的测试。在体外实验条件下，仅发现2株菌株(新鞘氨醇杆菌属 Leaf2和假单胞菌属 Leaf58)对Pst有抑制作用。在我们的实验中，假单胞菌属 Leaf58是保护拟南芥的菌株之一（附表1），而新鞘氨醇杆菌属 Leaf2没有植物保护作用。这一结果与在合成培养基上观察到的菌株之间的抗生素是植物保护中相当差的预测指标的概念是一致的。这可能是由于植物保护潜在其他机制，或者是在叶际环境条件下，没有足够浓度的抑制化合物，也可能是共生微生物定植密度不足以覆盖叶面，菌株呈斑块状空间分布。

除了像抗生素或营养物质竞争这样直接的微生物之间的相互作用，也可以通过增强植物抗性来间接保护植物。 平均保护得分大于75的28株菌株中，在触发模式的免疫缺乏的 bak1/bkk1 植株背景下，有2株表现出强烈的植物保护作用下降，另外有6株表现出较高的病原菌定植，这表明植物免疫对菌株保护作用的充分发挥是重要的。 值得注意的是，这些菌株中没有一株完全丧失保护功能。这一发现表明，多种机制以相互补充的方式提供保护，合成群落中的叠加效应也支持了这一观点，即比起各自最佳保护菌株的单独效果，10种和3种菌株的群落（M10.35，M3.1）表现出更好的保护效果（图4）。我们发现具有保护作用的菌株所属的菌科中至少有一个已知菌株是致病菌（图3），这就提出一个问题，即在植物微生物中，病原菌与共生菌株的感知和潜在区别。因此，使用这里生成的数据通过它们引发的潜在植物反应来测试可以在多大程度上区分具有保护作用和不具有保护作用菌株。

植物体内筛选为基因组推断分析作为一种识别保护模式的方法提供了基础。虽然系统收集的表型数据可用于识别相关的基因型-表型关系，但它们造成了区分真假系统发育关联的困难。本研究典型地关注1个菌科，该菌科在我们的实验中显示出一系列具有和不具有保护作用的菌株。基因组比较识别出了T6SS和根瘤菌Leaf202的植物保护作用之间的关联（图6）。T6SS在植物相关的微生物中富集，T6SS还具有微生物相互作用之外的功能，T6SS还与共生作用、生物膜形成、毒性有关。我们的观察拓展了T6SS参与植物环境中微生物间相互作用的其他报道。Leaf202  tssL 突变体表现出保护作用减弱，但没有完全丧失保护作用，因此正如上文所强调的，可能有多种保护模式协同作用。因此，测试具有保护作用的根瘤菌独有的基因（相比于不具备保护作用的根瘤菌），以了解它们对植物保护的潜在贡献是很有意义的。 另一个将来适合用于基因组分析的菌科是鞘氨醇单胞菌科， 该科最初在有限选择的菌株基础上被认为主要由保护性菌株组成，但在本研究中显示其所包含的不具备保护作用的菌株数量要多于具备的菌株。

结论

总之，我们收集了的 At -LSPHERE菌株中，约10%通过多重相互作用保护拟南芥免受假单胞杆菌侵袭，SynComs的可以提高保护效果，植物保护机制有多种。后者中的一些机制需要较近的空间距离，如细菌战，而其他的可能通过植物间接影响，因此可能是植物本身的作用。本研究展示的数据强调了 如何通过群落成员的能力来确定微生物群落的特性，并发现了从基因型到表型的因果关系。

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