酶被认为是实现高立体选择性的特殊催化剂，但其控制自由基反应性和立体诱导的能力落后于化学催化剂。焦磷酸硫胺素(ThDP)依赖酶是一种充分表征的系统，激发了N-杂环卡宾(NHC)的开发，但尚未证明在不对称自由基转化中可行。由于大自然倾向于避免可能对生物系统有害的自由基，因此缺乏生物相容性和通用的自由基生成机制。
鉴于此，
南京大学化学化工学院
黄小强特聘研究员、梁勇教授
和中国科学技术大学/中国科学院强磁场科学中心
田长麟教授
合作
，通过
蛋白质工程并结合有机光氧化催化作用，将依赖ThDP的裂解酶重新用作立体选择性自由基酰基转移酶（RAT）
。酶结合ThDP衍生的酮基通过光激发有机染料的单电子氧化选择性地生成，然后以高对映选择性与原手性烷基交叉偶联。通过这种方法，可以从醛和氧化还原活性酯制备出多种手性酮（35个实例，对映体过量率高达97%）。机理研究表明，
这种以前难以捉摸的双酶催化/光催化作用通过独特的ThDP辅助因子和可进化的活性位点引导自由基
。这项工作不仅扩大了生物催化的范围，还为用酶控制自由基提供了一种独特的策略，补充了现有的化学工具。相关研究成果以题为“A light-driven enzymatic enantioselective radical acylation”发表在最新一期《Nature》期刊上。
值得一提的是，黄小强教授，是1991年出生的，2020年，他就以第一作者的身份在《Nature》上发文，通过光催化和酶催化的结合，报道了一种光酶对映选择性分子间自由基加氢烷基化。
在自然界中，ThDP依赖的苯甲醛裂解酶，催化的是双电子的（可逆的）苯甲醛到安息香的转化,而一些文章表明自由基参与铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）催化（图1a）。受这一类酶的启发，合成化学家发展了一系列仿生氮杂环卡宾催化剂，并于近期用于催化自由基反应。综合利用仿生和化学模拟的思路（图1b），研究团队
利用可见光激发和定向进化手段，将ThDP依赖的苯甲醛裂解酶“重塑”为自由基酰基转移酶（RAT），实现了一例非天然的高对映选择性的自由基-自由基偶联反应
。
该成果首次将ThDP依赖酶用于催化非天然的自由基转化，同时实现了有机氮杂环卡宾催化不能达到的低催化剂负载量和高立体选择性的效果。
首先，作者选择4-甲氧基苯甲醛（1a）作为酰基供体，N-（酰氧基）邻苯二甲酰亚胺（2a）作为自由基前体。在ThDP依赖酶和有机光催化剂曙红Y的存在下，在N
2
气氛下用绿色发光二极管（530-540 nm LED）照射，初步筛选出依赖ThDP的酶库。虽然大多数测试的酶都没有提供产物，只有荧光假单胞菌的苯甲醛裂解酶（
Pf
BAL）显示出理想的反应活性，其目标酰基转移产物(S)-3a的产率为33%，e.e.为38%（图2b）。为了提高反应效率和对映选择性，作者采用了半理性迭代的特定位点诱变策略。通过分子动力学模拟发现
Pf
BAL 活性位点内可能存在自由基中间体（图 2c）。最终
他们通过分子动力学模拟和半理性设计构建了小而精的突变体库，能够快速、低成本地获取最优突变体酶。
有了最佳条件和工程RAT后，作者
开始使用RAT1、RAT2和RAT3(RAT1_A480G)进行底物范围调查
（图3）。各种对位带有给电子基团或吸电子基团的芳香醛具有良好的耐受性(3a–3m)。苯甲醛间位或邻位的取代基（3n和3o）也被接受，尽管产率和对映选择性较低。这种生物转化也能顺利进行，包括卤素（3h–3k、3w–3aa）、萘基（3p）和各种杂芳基醛，例如取代的吡唑基（3q）、吡啶基（3r）、苯并噻吩基（3s）和N-甲基吲哚基（3t））。多种N-（酰氧基）邻苯二甲酰亚胺很容易从普遍存在的羧酸制备，与双催化体系兼容，以良好的收率和优异的对映选择性（86-97%e.e.）提供相应的α-手性酮（3u-3ad）。值得注意的是，市售的外消旋抗炎药物洛索洛芬（3ae）和氟比洛芬（3af）以及天然存在的醛（3ag）被成功转化。缺氧诱导因子1α抑制剂的合成中间体(3ah)可以通过生物催化对映选择性方式合成。此外，脂肪族基团（3ad）和大叔基团（3ai）也被对映选择性酰化，突出了本催化的多功能性。
本文展示了35个例子，对映选择性最高达97%ee，凸显了酶可调的活性口袋对于游离自由基立体化学的精妙调控作用。
研究团队通过机理湿实验、电子顺磁共振谱学研究和理论计算等方法，对机理开展了详细研究，揭示了新酶反应性的关键以及高立体化学选择性的来源。他们提出了
非天然自由基酶促反应的光氧化和生物催化双重机制
（图4a）。首先，醛与RAT活性位点中的ThDP反应形成关键的布雷斯罗中间体（
Int. A
），该中间体易被单电子氧化。另一方面，曙红Y的光激发会产生氧化物种曙红Y
*
（E
1/2
（曙红Y
*
/曙红Y
.-
）=+0.83V，相对于饱和甘汞电极）。单电子转移导致形成持久的ThDP衍生酮基自由基（
Int. B
）和曙红Y自由基阴离子，后者应该会还原N-（酰氧基）酞酰亚胺，生成手性苄自由基（
Int. C
）（与饱和甘汞电极相比，E
1/2
（曙红Y/曙红Y
.-
）=-1.06V）。最后，
Int. B
和
Int. C
的自由基-自由基交叉偶联形成了C（sp
2
）-C（sp
3
）键对映选择性，并释放出具有催化活性的RAT。
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