北京大学邹鹏课题组Chem. Biomed. Imaging | 借助频闪显微术实现细胞膜电位变化的超时间分辨成像观测

经过数十年的发展，荧光膜电位成像技术已成为神经生物学家记录生物电活动的重要工具，在观测细胞群体兴奋性、神经环路组成模式和在体高通量记录等领域已大显身手。作为一种基于光学显微镜检测的技术，它相对于传统电生理方法极大地提高了观测的空间分辨率和观测通量，且大幅降低了对实验者的技术要求，因此有着广泛的应用前景。然而，尽管高性能的膜电位荧光探针层出不穷，但由于光学成像系统特别是相机制造工艺的限制，荧光膜电位成像技术当前在时间分辨率上仍远远落后于电生理技术。对于使用荧光膜电位成像技术的开发者和使用者来说，亟需一种在现有成像系统下突破成像速度壁垒的方法，实现在更大视野内对细胞内或细胞间生物电活动的高速精确观测。

近日， 北京大学邹鹏课题组开发了一种利用频闪显微术（stroboscopic microcopy）大幅提高荧光成像中采样率和成像视野的技术，称为频闪电位成像stroboscopic voltage imaging (SVI)，并发表在 Chem. Biomed. Imaging 上。 在大视野下难以开展高速成像的根本原因在于，相机的成像视野往往与可及帧速率呈反比关系。作者团队借用了运动摄影和单分子定位成像中频闪成像的概念，利用时间较短的闪烁光激发荧光探针以提高成像的时间分辨率。在不改变相机曝光时间即帧速率的条件下，他们创造性地使用时长为曝光时间1/5的频闪光来激发膜电位探针，实现了对生物电活动的高采样率、高时间精确度的超分辨成像（图1）。值得一提的是，在提高时间分辨率的同时，该方法同时还可以消除sCMOS相机处于卷帘快门（rolling shutter）模式工作时向成像视野不同区域引入的非同步曝光的误差，进一步提高了对电活动变化细节的记录精度。

图1. 使用不同位置的短脉冲激光进行频闪照明，提高相同曝光时间下膜电位成像的采样率

作者首先确认了各类膜电位探针（如QuasAr系列、ASAP系列和HVI系列）均适用于SVI技术（图2）。在频闪照明激发条件下，各类探针保持了原有的电位灵敏度和响应速度。

图2. 膜电位探针在采用频闪成像方法成像时（采样率为1474 Hz）相比传统方法（连续照明，实际采样率为295 Hz）具有相近的灵敏度 （A） 以及更快的响应速度 （B） （比例尺代表的长度为20 μm）。

随后作者利用SVI技术观察了HEK 293T细胞群体内由间隙连接（gap junction）介导的电信号传播过程。他们在90 μm × 80 μm的成像视野内以1474 Hz的采样率记录了5个细胞间的去极化传播过程（图3）。

在对神经元动作电位进行成像记录时，SVI技术相比传统方法能够更准确报告动作电位波形（图4）。对于同样大小的成像视野，SVI技术（图4B中的实线）获得的信号的采样率可达传统成像模式的500%，不仅可以给出更高变化幅度、更精细、更准确的动作电位波形，还克服了高速成像中卷帘快门曝光模式对视野内不同区域引入的时间误差，消除了来自同一神经元胞体但处于相机靶面上不同区域的动作电位成像信号的畸变。搭配亮度较高的复合型膜电位探针HVI-Cy3，可在220 μm × 160 μm的视野范围内以1 kHz的采样率对神经元的多个亚细胞结构进行动作电位成像，得到回传动作电位在多根树突内传播时发生的振幅和速度的变化，为对树突间的非均一传播过程进行深层次解析提供了可能（图4）。

在此基础上，作者将光谱正交的光遗传学工具CheRiff和膜电位探针HVI-AF594共同表达在神经元中，实现高速成像条件下的全光学电生理记录（all-optical electrophysiology recording）（图5）。在460 μm × 300 μm的范围内对神经元多根树突中的回传动作电位（back-propagating action potential）细节进行观测，记录到速度超过200 μm/ms的回传动作电位传播过程，发现了动作电位传播速度在较粗的主干树突中更快，而在经分枝点产生的较细树突中较慢（图5）。

图5. （A-B） 利用光谱正交的光遗传学工具CheRiff和膜电位探针HVI-AF594（A），通过对4次SVI采集并对数据加以整合，即可对该460 μm × 300 μm区域完成781 Hz的动作电位成像（B）； （C） 由动作电位成像数据经线性插值后求得的视野内各像素点动作电位相对到达时间（黑白交叉线的区域未采集到有效数据）； （D） 将图C中的传播过程以Δt = 0.1 ms的间隔进行可视化展示的效果（比例尺代表的长度为50 μm）。

综上所述，北京大学邹鹏团队发展了基于频闪照明的高速膜电位成像方法，解决了长期以来成像视野与相机采样率难以兼得的技术难题。相较其他大视野高速成像方法，SVI无需对显微成像装置进行复杂的升级，且提供的成像视场形状规整，具有较高的光子预算(photon budget)，可以便利地实现在较大视野下对细胞电活动进行高通量快速记录，得到更具时间分辨率和时间精度的观测结果。SVI膜电位成像技术有望和近年来发展的高灵敏膜电位探针“双剑合璧”，成为生理学家和神经科学家研究细胞间电通讯、细胞内电传播过程以及筛选调控相关过程的药物分子等基础研究的工具箱中的利器。

相关论文发表在高质量期刊 Chemical & Biomedical Imaging 上，北京大学化学与分子工程学院已毕业博士生彭陆鑫为文章的第一作者， 邹鹏研究员 为通讯作者。北京大学未来技术学院陈知行实验室提供了实验相关的化合物。本工作得到了科技部、国家自然科学基金委、北京分子科学国家研究中心生物、有机与分子工程教育部重点实验室和北大-清华生命科学联合中心的资助。