农科院杨新伟：以酶进化和代谢工程技术高产γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸（GABA） 是一种四碳非蛋白氨基酸，参与植物、动物、微生物的多种生理生化代谢过程。此外，GABA作为脊椎动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质， 被用于制药和功能食品中，也是吡咯烷酮和可生物降解聚酰胺尼龙合成的主要组成部分 。

因此， 为了满足各个行业需求，需 要开发GABA的经济型生产。GABA是通过谷氨酸脱羧酶（GAD）将谷氨酸脱羧合成的 ，GAD是一种依赖于吡哆醛5，-磷酸（PLP）的细胞内酶并参与抗酸系统。

研究内容：

近日， 中国农业科学院杨新伟团队 通过结合酶进化和高通量筛选方法，对实验室前期研究的谷氨酸脱羧酶（GadBM4）进行改造，获得了GadM4-2、GadM4-8和GadM4-31三个突变体，进一步提高了GABA的产量。此外，引入PLP生物合成途径中不依赖DXP的酶，构建PLP自供系统，并在5 L生物反应器中应用全细胞催化合成GABA。

图1酶进化和代谢工程技术提高GABA产量的生物合成途径。

利用实验室前期构建的质粒pRB-GadB（M4）扩增GadB（M4）初始基因，采用易错PCR对GadBM4进行随机突变，构建了GadB（M4）随机突变文库。筛选出具有高GAD活性的突变体，将最佳的3个突变体（GadM4-2、GadM4-8和GadM4-31）用于GAD的纯化和酶活鉴定。

对GABA产量最高的三个突变体进行测序分析发现，与原GadBM4相比，三个突变体基因的碱基均发生改变。在pH值为4.6时，两个氨基酸取代突变体(GadM4-2和GadM4-8)蛋白的比活性分别比原GadBM4蛋白高1.62倍和1.75倍；而仅碱基取代（氨基酸不改变）的GadM4-31的比活性略有提高。当pH值为6.0时，虽然4种GadB蛋白的比活性比pH值为4.6时下降了5~7倍以上，但GadBM4-2和GadBM4-8的比活性仍比原GadBM4高119%和95%。

两个氨基酸取代的突变体在两个pH值下都表现出更好的性能，而GadBM4-31的性能与原酶相似。与原GadBM4相比，GadBM4-2和GadBM4-8的催化效率（kcat/Km）在pH为6.0时分别提高了3.29和2.57倍，在pH为4.6时分别提高了1.68和1.87倍。GadBM4-31通过改变Asp（227）、Gly（331）和Val（425）的密码子来改善蛋白的可溶性表达，而性能并未改变，相反，GadM4-2和GadM4-8在酸性和中性条件下均具有较高的活性，因此是GABA生物合成的候选材料。

GadC（一种膜结合转运蛋白）与连接体的共表达会导致可溶性蛋白积累不良，而过量的GadC可能会破坏膜的完整性，导致最终生物量降低，从而限制GABA的产生。为了增强GadC的表达活性，在大肠杆菌中加入抗酸系统转录激活剂GadE，结果发现， GadE可以正向调节基因组中GABA的表达。

为了减少或消除在系统中增加额外的辅助因子PN或PL的需要，建立了PLP自供系统。引入了不依赖于DXP的PLP生物合成途径。结果表明，在不添加辅助因子的情况下，引入枯草芽孢杆菌来源的不依赖于DXP的酶可提高GABA的产量，比重组菌株和原菌株分别提高12.46%和50.24%。在5 L生物反应器中进行全细胞生物转化，以粗L-Glu（含量：98.5%）作为底物加入体系，不添加任何辅助因子，在8 h的转化过程中，反应混合物的pH从3.91增加到约6.18，两株菌株在此过程中几乎全部将L-Glu转化为GABA。

总结：

利用携带突变体GadBM4-2的重组大肠杆菌细胞进行全细胞生物转化获得的GABA产量比原GadBM4提高了20.27%。进一步引入抗酸系统的中心调控因子GadE和不依赖于DXP的PLP生物合成途径的酶，使GABA的产率提高了24.92%，达到76.70g/L/h，转化率大于99%。

最后， 在5 L的生物反应器中进行全细胞催化，以粗L-Glu为底物，GABA滴度达到307.5±5.94 g/L，产率为61.49 g/L/h 。因此，上述构建的PLP自供系统与全细胞生物转化程序相结合是GABA工业化生产的有效途径。