「一文打尽」细胞因子检测常见免疫学技术

✔ 传统 Western Blot

✔ 全自动毛细管 Digital Western（Simple Western）

✔ 传统 ELISA

✔ 全自动微流控 ELISA

✔ 免疫斑点法 ELISpot/FluoroSpot

✔ 微球免疫分析技术 CBA

✔ 电化学发光

✔ 液相芯片技术 xMAP

✔ 临近延伸分析技术 PEA

✔ 单分子免疫阵列技术 SiMoA

传统蛋白质免疫印迹法（Western Blot，WB）是一种常见的蛋白质免疫分析技术，被应用于确认特定蛋白质的存在并进行定性和半定量分析。WB实验基于抗原抗体特异性反应，经过SDS-PAGE分离蛋白质后，将其转移到硝酸纤维素薄膜（NC）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。随后，使用脱脂牛奶封闭液进行封闭，一抗稀释液进行孵育。蛋白质与抗体结合后，通过洗涤去除未结合的一抗，接着加入酶标记或者荧光标记的二抗。最后，利用化学发光液或者特定的激发光源，对靶蛋白进行检测，可以通过胶片、化学发光仪或荧光成像仪进行成像，最终捕捉到蛋白条带。传统WB检测实验流程相对复杂时间较长，需要熟练的实验技术，对操作者需要有一定的经验。

作为创新性毛细管电泳免疫学技术，全自动毛细管Digital Western（也称Simple Western）将Western Blot技术和ELISA技术合二为一，具备传统WB蛋白质可视化定性优势，同时具备ELISA免疫学实验精准定量能力，其灵敏度和精密度符合高标准生物分析要求，可利用超微量样本实现内源性蛋白质精准定量。自动化规避了传统WB和SDS-PAGE劳动密集型操作引入的人为误差。仅需要微量样本（3 μL）即可实现多重蛋白质表达检测，节约珍贵样品，例如，外泌体、分选干细胞、显微切割、类器官、生殖细胞等等。全程试验无人值守，3小时即可获取25个实验样品数据。可精准定量，覆盖从体外细胞水平到体内组织水平实验，建立药物与蛋白质表达水平的量效关系和时效关系曲线。原始数据不会被篡改，不被审稿人质疑。

图片来源：全自动毛细管Digital Western产品手册

酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ，ELISA) 是一种常用的免疫测定方法，通常用于定量检测样本中目的蛋白的水平。利用ELISA检测的样本包括血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解物、唾液、组织裂解物和尿液。ELISA通常在96孔板中进行，孔板中包被有一种捕获特定分析物的抗体。在与实验样本、标准品或对照品孵育后，目标分析物将被这种抗体捕获。随后使用结合到目标分析物不同抗原表位的检测抗体完成"夹心"结构。接着加入底物溶液，产生的信号与结合的分析物量成比例。ELISA有不同形式，包括直接法ELISA、间接法ELISA、夹心法ELISA和竞争法ELISA。

夹心法ELISA

 图片来源于：What is an ELISA & Types of ELISAs: R&D Systems

全自动微流控免疫分析平台克服了传统ELISA技术手动操作步骤多、时间长、样本量大、重复性差和结果不可靠等局限。利用创新的微流控卡盒，全自动生物标志物检测平台可快速获取高质量数据结果，同时可对多种生物标志物进行多通道同步检测。其检测原理如下图所示，特异性捕获抗体包被在纳米级微量反应管（Glass Nano Reactor，GNR）中，再将GNR嵌入微流控管路内。相关的抗体对和试剂已经被预先包被在卡盒中，并且经过严格验证，卡盒拿来即用，方便快捷。卡盒出厂内置标曲，无需制作标准曲线。微流控ELISA平台可自动取样本和检测，最后自动输出2~3个平行GNR的数据及均值。传统的多重检测可能会出现交叉反应和干扰，从而降低数据质量。而微流控ELISA可将待测样本分配到四个平行的微流控管路中，同一管路内最多只进行两重检测，从而消除交叉反应信号串扰的问题。

图片来源：全自动微流控ELISA平台--Ella产品手册

免疫斑点法ELISpot是一种定量和定性的实验，它基于夹心ELISA免疫分析原理，旨在计数细胞因子分泌细胞。它的灵敏度极高，因此在检测低量细胞因子分泌细胞（1/300,000）方面非常有效。对抗原的细胞因子释放可以映射到单个细胞，因此可以计算T细胞应答频率。细胞可以在抗细胞因子抗体涂覆的板上进行刺激（直接法），也可以进行预刺激，然后转移到预涂覆的板上（间接法）（下图上）；一旦实验完成，可以在读板器上对板进行分析。近来，该实验已经改进迭代为FluoroSpot实验，利用荧光染色的检测抗体，从而允许同时检测多种不同的细胞因子并进行随后的T细胞亚群分析（下图下）。ELISPOT/FluoroSpot实验的主要应用在于监测人类和动物的免疫应答反应、药物研发、癌症、自身免疫性疾病和疫苗等研究中。

 图片来源：British Society for Immunology

微球免疫分析技术CBA （Cytometric Bead Array，CBA）是基于流式细胞术（Flow Cytometry）的原理。CBA使用微米级荧光标记的珠子，每种珠子上带有特定抗体，这些抗体能够与感兴趣的细胞因子相结合。珠子被混合在待测样本中。每种珠子具有不同的荧光信号，以便后续流式细胞仪的检测和区分。样本中的目标细胞因子或蛋白质与珠子上的相应抗体结合，形成免疫复合物。通过洗涤步骤去除未结合的成分，确保只有与抗体结合的珠子被保留。荧光标记的二抗被引入系统后，与免疫复合物中的抗体结合，从而标记了被检测的分子。珠子和样本经过混合和处理后，使用流式细胞仪来分析每个珠子的荧光信号。通过测量珠子的荧光强度，可以确定样本中特定蛋白质或细胞因子的浓度。

 图片来源：bdbiosciences

电化学发光（Electrochemiluminescence）是基于ELISA基本原理的一种技术，使用96/384微孔板中（采用石墨材质，背面带有电路）作为底板，捕获抗体形成夹心复合物。待测样本和三联吡啶钌标记的检测抗体加入后，微孔板被置于电化学发光检测仪器中，通电后发生化学反应，使[Ru(bpy) 3 ] 3+转变为[Ru(bpy) 3 ] 2+，然后再还原为[Ru(bpy) 3 ] 3+，形成循环反应。在此过程中，释放的光子（波长620nm）由检测仪器中的CCD相机捕获，其释放量与待测物的浓度成正比。多个激发周期可以放大信号，提高了检测灵敏度。

图片来源：MSD官网

液相芯片技术的核心原理是使用两种不同比例的红色荧光染料将聚苯乙烯微球（塑料珠）或超顺磁微球（磁珠）染上不同的颜色，形成多达几十种不同颜色的微球编码。微球表面包被了针对目标物的特异性抗体。之后将针对不同待测物的抗体或基因探针共价连接到特定编码的微球上，每个编码微球对应一个检测项目。首先将不同待测物的编码微球混合，然后加入待测物或扩增片段，形成的复合物与标记的荧光素发生结合反应。微球在流动液体的带动下单独通过红光和绿光激光，红光用于确定微球的荧光编码，绿光用于测定微球上报告分子的荧光强度，从而实现快速准确的定量检测。液相芯片技术可实现对多因子进行检测。

图片来源：Hell Cage

临近延伸分析技术（Proximity Extension Assay, PEA）是能够利用微量的血清、血浆或几乎任何其他类型的生物样本进行高通量、多重免疫检测。其检测原理基于抗体免疫分析和PCR或二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术，96个寡核苷酸抗体对中的每一对都包含唯一的DNA序列，只允许彼此杂交。随后的邻近延伸将创建96个唯一的DNA报告序列，这些序列将通过实时PCR进行扩增。多重免疫测定的限制因素是抗体的交叉反应，这会将大多数测定的多重测定程度限制在10重以下。但是该技术不会检测到交叉反应，无串扰，因为只有匹配的DNA报告对才能够杂交以产生用于NGS或实时qPCR的扩增子。这允许进行可扩展的多重测定而不损失特异性和灵敏性。

图片来源：Olink官网

单分子免疫阵列技术（Single Molecule Array, SiMoA）基于微阵列芯片单分子免疫检测，其原理就像是在一个微小的反应容器（微井）中放大信号。微井把待测物和检测抗体捕捉在一个特定区域内，形成一种单分子级别的反应环境。这个微小的反应容器不仅能够隔离待测物，还能够增强信号，使能够观察到微小到单分子水平的事件。当目标分子与检测抗体结合时，引入荧光或其他标记物，产生可观测的光信号。单分子免疫阵列技术的灵敏度非常高，能够检测到极低浓度的分子，使得对罕见或微量分子的检测成为可能。

 图片来源：Cedars Sinai