真的假的？构建质粒这些知道的越少，成功率越高
真的假的？构建质粒这些知道的越少，成功率越高
ShengWuXueBa
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新手质粒构建，总会遇到五花八门的问题：酶切后跑胶条带弥散、酶切后跑胶有多余条带、酶切不完全、测序后发现连上的不是正确的目的基因...... （文末可免费领取礼品哦）
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然而一问身边构建厉害的人，人家早就避开这些坑了，导师群里询问两个月构建载体进展时，我只能厚着脸皮说，好消息：又见多识广了，坏消息：是阴性结果！当我把跑胶图发给导师后，导师头也不回的退出群聊……
别慌！今天学霸君给大家整理了 常见载体构建问题踩坑的原因 ，希望你经历的越少越好，如果实在犯了错，也可以补救回来。
酶切后 DNA 琼脂糖凝胶电泳弥散状
可能原因 1：内切酶与底物 DNA 结合
解决方法： 降低使用的酶量；向上样缓冲液中加入 SDS（0.1～0.5%）以分离酶与 DNA。
可能原因 2：核酸酶污染
解决方法： 使用新配制的无污染的电泳缓冲液；使用新配制的琼脂糖凝胶；对 DNA 进行纯化。
酶切不完全
可能原因 1：盐的抑制
解决方法： 在含有盐的缓冲液中活性低的酶，可能是对盐敏感，可在酶切前先纯化 DNA；使用离心柱的 DNA 纯化方法可能会造成高盐离子水平，从而抑制酶活性，要避免该情况发生，DNA 溶液体积不应超过总反应体系的 25%。
可能原因 2：PCR 组分的抑制
解决方法： 在进行酶切前对 PCR 片段进行纯化。
可能原因 3：使用的酶量过少
解决方法： 每 μg 的 DNA 至少使用 3～5 单位的酶。
可能原因 4：DNA 被抑制剂污染
解决方法： 小量制备的 DNA 尤其容易受到污染物的影响，推荐使用质量有保证的 DNA 纯化试剂盒；或者增大反应体系以稀释污染物。
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胶中出现多余的条带
可能原因 1：如果胶中发现比预期更大的条带，这可能是由于酶与底物结合
解决方法： 降低反应中的酶量；向上样缓冲液中加入 SDS（0.1～0.5%）以分离酶与底物
可能原因 2：酶的星号活性
解决方法： 使用随酶提供的推荐缓冲液；降低反应中酶量，同时确保酶量不超过反应总体积的 10%，这样确保甘油总浓度不超过 5% v/v；减少反应时间，使用完全酶切所需的最短反应时间，以避免星号活性。
可能原因 3：内切酶部分消化
解决方法： 在进行酶切前先纯化 PCR 片段，避免高盐离子浓度对酶的活性造成影响；使用随酶提供的推荐缓冲液；每 μg 的 DNA 至少使用 3～5 单位的酶；消化 DNA 1～2 小时。
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从常见问题的解决方法不难看出，保证限制性内切酶正常发挥功能，可以避免很大一部分的阴性结果，实验技巧和试剂两手抓，一周搞定载体构建不是梦！实验试剂选择优质大牌更靠谱，NEB一直致力于开发高纯度和优质的限制性内切酶，高稳定、高保真。
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内容策划：潘成 内容审核：吴军
图片来源：NEB
题图来源：自己做的