江南大学刘龙团队：设计芽胞杆菌多级温控线路以增产岩藻基乳糖

通过合成生物学和代谢工程改造的微生物可以有效地合成各种有价值的产品，开发能够对多个模块进行精确和动态控制的高性能电路对于构建用于生物生产的高效微生物细胞工厂至关重要。动态代谢控制需要基因回路，这些基因回路通常基于响应外部诱导物、细胞内代谢物、环境因素或细胞生长的不同生物传感器而设计的，尽管最近设计了一些用于动态调节的基因回路，但在不同发酵阶段精细调节基因表达仍然具有挑战性。

近日， 江南大学刘龙课题组 在《Nucleic Acids Research》上发表了文章“A pathway independent multi-modular ordered control system based on thermosensors and CRISPRi improves bioproduction in Bacillus subtilis”，作者通过结合热传感器和成簇规则间隔短回文重复干扰(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference, CRISPRi)，‍创建了新的可编程的温度响应遗传电路，可用于代谢中多模块的有序控制。

作者首先基于温度敏感的转录因子CI857在枯草芽孢杆菌中构建了具有不同转变点的正交温度响应生物传感器。来自λ噬菌体的热敏转录调控因子CI857及启动子PR是众所周知的热调节系统，作者利用PR表达绿色荧光蛋白，该系统呈现出弱基因表达时，相对荧光强度为150，因此，作者将转变点定义为相对荧光强度超过150的温度。

作者观察到启动子PR在39°C下可以工作，在42°C(452)下的动态范围为2.4，性能较差，为了获得高性能的正交温度响应生物传感器，作者选择强组成型启动子Pveg作为基础启动子，同时通过改变启动子区域内CI857结合位点的位置来调节该系统的特异性和敏感性，其中Pveg5（-35区域的上游插入CI857结合位点OR2，-10和-35区域之间插入CI857结合位点OR1）在34°C以下几乎没有泄漏表达，并且在34至42°C的温度范围内具有39.5的高动态范围，且Pveg5的强度与温度呈正相关。

为了构建更多具有不同转变点的温度响应型生物传感器，作者构建了一系列启动子 P veg5的突变体。然后，作者结合CRISPRi系统，利用Pveg5表达dCpf1蛋白，设计并构建了双功能遗传电路。最后，作者在枯草芽孢杆菌中设计了 2’-岩藻糖基乳糖 （2′-fucosyllactose, 2’-FL）的从头合成途径，来验证温度响应性遗传回路是否可用于控制细胞代谢。作者使用温度响应遗传电路对2’-FL的生产进行多模块有序控制，摇瓶中2’-FL滴度从356.5 mg/L增长到1839.7 mg/L，在5-L生物反应器中，2’-FL滴度达到28.2 g/L。

综上，作者为枯草芽孢杆菌的动态调节提供了一种有效的工具，可用于改进其他底盘细胞和其他化合物的代谢模块。

（冷静 摘译）