ACS Chem. Biol. | 通过同基因型形态学分析发现分子胶降解剂

作者使用经过临床验证的E3连接酶CRBN来测试同基因型CPA的概念。与其他E3连接酶相比，CRBN具有最多已报道靶向各种蛋白质的MGD，这些已知的MGD可以用作同基因 CPA的CRBN依赖对照。此外，CRBN在其靶标上有一段识别序列，称为G环。计算估计，共有600 到 2500 多种蛋白质含有G环，这有可能为发现新靶点的MGD提供机会。

作者使用了邻苯二甲酰亚胺和苯基戊二酰亚胺两种支架来进行化合物的衍生。苯基戊二酰亚胺是报道的高亲和力CRBN结合剂，目前仅被用于PROTAC的合成。首先作者通过苯酚的氟磺化制备了一系列磺酰氟。这些磺酰氟与脂肪胺的SuFEx反应能够产生结构不同的磺胺的化合物库（ 图1A ）。作者合成了包含132种化合物的库，并选择了9种CRBN依赖的双功能降解剂和MGD以及6种CRBN非依赖化合物作为对照用于测试。此外，作者还使用已知可诱导不同形态学变化的化合物作为形态学对照。在同基因型CPA实验中，作者使用了三种表达不同水平CRBN的同基因型RKO细胞系，分别为WT RKO、敲除CRBN基因的CRBN-KO RKO和回补CRBN基因的CRBN-OE RKO。在该方法中，细胞被接种至平板24小时，然后化合物处理48小时，再对细胞进行染色和固定并获取图像信息。作者从这些图像中收集形态学特征的信息，包括3005种形态学特征的Z评分。然后进行特征选择，并根据图谱对化合物生物活性进行预测和解释（ 图1B ）。

首先，作者探索了 WT RKO的形态特征并进行计算分析，称为全局特征选择。作者选择了470个特征，并可根据这些选定特征做出各种解释，包括形态扰动强度。与形态学对照FK-866等其他对照相比，CRBN依赖对照倾向于诱导轻至微弱的形态学变化（ 图1C-E ）。许多化合物在有限范围内诱导细微的形态变化，只有少数化合物能诱导出强烈而独特的形态（ 图1E ）。因此CPA的分析通常采用大量针对广泛生物靶标的参考化合物来评估测试化合物的生物活性。若测试化合物能够诱导与参比相似的形态变化，则说明测试化合物具有相似参比的生物活性。然而目前仍然缺乏CRBN依赖降解剂的报道。因此作者采用了一种使用多种同基因细胞系的策略，通过检查化合物在不同细胞系中诱导的特征变化来描述化合物的CRBN依赖性。若化合物具有CRBN依赖性，则化合物诱导的特征变化幅度，即 Z 评分与细胞系的CRBN表达水平相关。这种策略称为“以处理为中心的特征选择”（Treatment-centric feature selection），这些CRBN依赖性的特征也称作“以处理为中心的特征”。

图2. 以处理为中心的特征选择用于CRBN依赖性预测

作者分析了三种同基因型细胞系在化合物处理后的形态学特征。随后，通过Kendall τ _b 相关系数选择了 Z 评分和CRBN表达水平相关的特征（ 图2A ）。然而，某些特征会偶然与CRBN表达水平相关。因此作者对每个观察结果所有CRBN依赖性特征的Z评分进行平均，并使用 Mann-Whitney U 检验比较了CRBN-KO RKO和CRBN-OE RKO中的平均Z评分，校正后得到 U 评分（ 图 2B,C ）。 U  > 0.5代表化合物具有CRBN依赖性，并且U评分越高表示预测的置信度越高。作者使用了TL13-12对该流程进行了标准测试。之前已经发现TL13-12在CRBN-KO RKO和CRBN-OE RKO之间诱导明显的形态变化。该化合物校正后的 U 评分为 0.999，因此可以预测TL13-12是一种具有CRBN依赖性生物活性的化合物。将该方法拓展到所有其他化合物，作者发现所有CRBN依赖对照的校正 U 评分均在0.7以上，并将0.7作为阈值 0.7 来进行预测（ 图 2D ）。使用同基因型CPA筛选的159种化合物中，有17种化合物至少具有5种特征与CRBN表达量相关，U ≥0.7，其中8种来自化合物库，其余9种是CRBN依赖对照。然而，这些特征可能会有很大差异，反映了这些化合物调节或降解涉及各种生物通路的靶标。随后作者使用余弦相似度计算来衡量不同化合物在CRBN表达量相关特征的相似性，并绘制了一个力定向网络图，其中粗线表示两种化合物的相似度较大，蓝色表示CRBN依赖对照（ 图 2E ）。     

最后，作者发现 FL2-14 与所有已知的CRBN依赖对照具有低相似性，与沙利度胺具有相当的CRBN亲和力，且具有独特的尾基修饰化学结构，预计具有CRBN依赖性生物活性（ 图 3A ）。因此作者进行了定量蛋白质组学，以寻找 FL2-14 的靶标。他们发现3种蛋白质显著下调，即GSPT2、FAM83F和ZBTB39（ 图 3B ）。GSPT1和GSPT2是同源蛋白，但 GSPT1 在多种细胞系中是关键的，而GSPT2在1095种测定细胞系中的任何一种中都不是关键的。 GSPT2和GSPT1密切相关，并且在功能上都参与翻译终止，然而 FL2-14 能够优先导致GSPT2的降解。在GSPT1和GSPT2 的AlphaFold模型中，GSPT2具有扩展的无序C末端结构域，但在其他部分与GSPT1具有相同的结构，包括G环序列（ 图 3C ）。蛋白质印迹分析显示 FL2-14 确实更优先降解GSPT2，而在CRBN-KO RKO中 FL2-14 无法导致GSPT2降解（ 图 3D ）。在亚微摩尔范围内和HEK293T细胞中也能观察到 FL2-14 诱导GSPT2降解（ 图3E ）。用天冬酰胺取代G环中的甘氨酸也使得 FL2-14 无法诱导GSPT2的降解（ 图 3F ），证实了GSPT2中G环的存在。

总结而言，作者开发了同基因型CPA并进行了标准化合物的测试。作者使用同基因型细胞涂染试验从CRBN结合配体衍生的化合物中鉴定出基于CRBN的分子胶降解剂。通过比较化合物诱导的不同CRBN表达水平细胞系的形态学特征，作者成功地将CRBN依赖对照与CRBN非依赖对照区别开来。最后，作者选择了 FL2-14 进行进一步验证，确定并验证了GSPT2作为 FL2-14 的靶标，且 FL2-14 以CRBN依赖的方式诱导蛋白降解。有趣的是，相比关键的GSPT1，FL2-14更优先降解GSPT2。GSPT2是终止释放因子，在人类中GSPT1和 GSPT2具有近88 %的同一性，这两种同系物也在大多数人体组织中表达，然而GSPT2水平通常低于GSPT1。GSPT1被认为是影响翻译终止的主要因素，有证据表明GSPT2可以部分替代 GSPT1。到目前为止，GSPT2的作用一直没有研究清楚。 FL2-14 可能是一种有用的化学探针，用于GSPT2作用的研究。最后，作者开发的同基因型CPA和计算分析预计将有助于MGD发现。