MCP | CRC患者组织浸润性T细胞的定量蛋白质组学研究发现LCN2通过铁外排诱导T细胞凋亡并促进肿瘤细胞增殖

  大家好，今天给大家分享的文章是 2024 年 1 月发表在 Mol Cell Proteomics 上名为 Quantitative Proteomics of Tissue-Infiltrating T Cells From CRC Patients Identified Lipocalin-2 Induces T-Cell Apoptosis and Promotes Tumor Cell Proliferation by Iron Efflux 的研究性论文。文章的通讯作者是来自北京大学生命科学学院的季建国教授，该研究发现脂载素 -2 （ LCN2 ）具有促进肿瘤发展及免疫抑制功能，是结直肠癌的潜在治疗靶点。

背景

       T 细胞是抗肿瘤免疫的核心，肿瘤微环境中的 T 细胞表现出异常的蛋白表达模式，导致 T 细胞功能障碍从而促进肿瘤发展、转移或免疫逃逸。结直肠癌（ CRC ）是一种缺乏有效靶向治疗策略的恶性肿瘤，例如抗 PD-1 免疫治疗仅对 4%-5% 的微卫星不稳定型结直肠癌有效，而该类型患者仅占不足 15% ，绝大多数患者为微卫星稳定型。因此，利用免疫治疗结直肠癌有巨大发展潜力，但我们对结直肠癌的肿瘤免疫微环境的认识尚不全面。

主要内容

1. CRC 患者组织中 T 细胞的相对定量蛋白质组学研究

  为了描绘 CRC 中 T 细胞的特征，作者对 CRC 临床样本中浸润 T 细胞进行了相对定量蛋白质组学研究。首先，作者收集了 13 例 CRC 患者的肿瘤组织及配对的远端正常组织（ DNTs ） , 使用免疫磁珠在组织中分离出 CD8+T 细胞核 CD4+T 细胞，利用流式细胞术检测磁珠分选的纯度约 95% （图 1a-b ）。随后，作者通过 TMT 标记对分离的 T 细胞进行了相对定量蛋白质组学分析并从中筛选出了 258 个差异表达蛋白（ DNPs ），其中在 CD4+T 细胞中 115 种蛋白上调， 66 种蛋白下调；在 CD8+T 细胞种， 35 种蛋白上调， 64 种蛋白下调（图 1c-d ）。此外，还筛选了几个已知的免疫治疗靶点和临床诊断标志物（图 1e-f ），这些结果支持了该筛选方法的有效性。接下来，作者利用 STRING 数据库对 DEPs 进行了 GO 通路富集分析，生物过程富集结果表明，上调的蛋白主要参与由金属离子转运体介导的细胞稳态及免疫过程，下调蛋白主要富集与细胞结构维持、淋巴细胞活化和淋巴细胞免疫应答（图 2a-b ）。总之，这项蛋白质组学研究描述了 CRC 中 T 细胞的的蛋白质表达特征。

Fig1. Validation of the purity of sorted T cells and DEPs screening from CRC patient proteome data.

Fig2. Gene Ontology (GO) enrichment analysis of the DEPs from T cells in CRC patient tumors.

2. LCN2 是关键 DEP 且促进 T 细胞凋亡

  为了筛选关键 DEP ，作者通过多次筛选，得到了三个关键 DEP ： LCN2 、 CHGA 和 CNN2 ，并使用 GEPIA 数据库在 RNA 水平及 Western Blot 在蛋白水平验证了它们的表达（图 3 ），最终作者选择 LCN2 进行进一步研究。作者在急性 T 淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat 中过表达了 LCN2 ，经 CCK8 实验发现 Jurkat 细胞数量减少，使用流式细胞术检测凋亡信号发现过表达 LCN2 促进细胞凋亡（图 4 ）。

Fig3. Screening and validation of DEPs reveals that LCN2 is a key DEP in CRC tumor–infiltrating T cells.

Fig4. LCN2 reduced Jurkat cell number by promoting cell apoptosis.

3. LCN2 通过减少胞内铁诱导细胞凋亡

  为了进一步探索 LCN2 如何促进细胞凋亡，作者将过表达 LCN2 的 Jurkat 细胞进行了相对定量蛋白质组学研究，采用 EdgeR 差异分析筛选 DEP ，并对 DEPs 进行了 Reactome 通路富集，结果表明一些下调蛋白富集于电子传递链 complex I 的生物过程中。同时，一些研究报道了细胞铁对于 complex I 活性很重要，而 LCN2 是一种铁转运蛋白，上述研究表明 LCN2 能够促进细胞凋亡。为了验证 LCN2 是否通过减少细胞内铁诱导细胞凋亡的，作者通过钙黄蛋白染色来检测细胞铁，研究表明 LCN2 过表达后降低了细胞铁浓度，且在 mRNA 和蛋白水平上 LCN2 均下调了铁蛋白轻链（图 5 ）。使用铁补充剂（ FC ）能够逆转 LCN2 对 Jurkat 的影响，改善细胞凋亡，同时这些结果也得到了 Western blot 的验证（图 6 ）。因此，这些结果证实 LCN2 可以通过降低细胞铁诱导细胞凋亡。

Fig5. LCN2reducedcellular iron concentration in Jurkat cells.

Fig6. Cellular iron regulated cell apoptosis in Jurkat cells.

4. LCN2 通过微环境促进肿瘤细胞增殖

  接下来，作者想确定铁被运输到了哪里从而导致细胞中铁浓度降低。因此，作者利用免疫荧光验证了 LCN2 在 Jurkat 中的分泌和细胞定位，结果显示 LCN2 在细胞质中表达并分泌到细胞外间隙，同时收集 Jurkat 上清液进行 Western blot 也证实了这一点（图 7a-b ）。肿瘤细胞的快速增殖伴随着在微环境中有更高的营养需求，有报道显示微环境中的铁有助于肿瘤细胞生长。随后，作者验证了 LCN2 分泌的铁是否利于肿瘤细胞生长，作者将过表达 LCN2 的 Jurkat 细胞与 HCT116 细胞共培养后， HCT116 细胞数量增加，表明 LCN2 有促进肿瘤发展的潜力。将过表达 mCherry 的 Jurkat 细胞与过表达 GFP 的 HCT116 细胞共培养后进行分离，作者发现在 mRNA 水平，在共培养的 Jurkat 细胞中检测出 LCN2 及 FTL ，而在 HCT116 细胞中发现 LCN2 增加了细胞增殖标志物 Ki67 和 PCNA （图 7d-h ）。这些结果证明了 LCN2 通过微环境促进肿瘤发展，也证明了 LCN2 可作为免疫治疗的潜在靶点。

Fig7. LCN2 promoted tumor cell proliferation via the microenvironment.

总结

  本研究主要收集了 CRC 患者的肿瘤组织和配对的远端正常组织，并对组织中的 T 细胞进行分类，通过 TMT 标记对 T 细胞进行了相对定量蛋白质组学研究，利用生物信息学分析描述了 T 细胞的蛋白表达模式并筛选出了关键 DEP-LCN2 。接下来，以 Jurkat 细胞模型对 LCN2 的功能进行了进一步探索，结果表明 LCN2 能够通过降低细胞内铁浓度诱导 T 细胞凋亡，且铁外排后增加了肿瘤微环境中的铁浓度，能够促进肿瘤发展。综上所述，本研究证实了 LCN2 可作为免疫治疗的潜在靶点。

撰写人：袁琪

DOI：10.1016/j.mcpro.2023.100691

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