江南大学 | 代静新，宋伟，吴静，等：ZIF-8-戊二醛固定化细胞生产α-酮戊二酸
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中国化工学会会刊，EI、SCOPUS等收录，中国科技期刊卓越行动计划入选期刊，2020版《中文核心期刊概目要览》化工类第1名
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ZIF-8-戊二醛固定化细胞生产 α -酮戊二酸
代静新 1 ，宋伟 1 ，陈修来 2 ，刘立明 2 ，吴静 1
1 江南大学生命科学与健康工程学院，江苏 无锡 214122； 2 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122
● 引用本文： 代静新, 宋伟, 陈修来, 等. ZIF-8-戊二醛固定化细胞生产 α -酮戊二酸[J]. 化工进展, 2022, 41(12): 6522-6530.
● DOI： 10.16085/j.issn.1000-6613.2022-0385
文章摘要
为了提高表达L-谷氨酸氧化酶（LGOX）重组大肠杆菌的催化稳定性，本研究采用了沸石咪唑框架（ZIF-8）涂层和戊二醛（GA）交联的组合固定技术。确定了ZIF-8和GA的工艺参数以及固定化细胞的催化性能，并对固定化重组大肠杆菌催化L-谷氨酸生产 α -酮戊二酸（ α -KG）的稳定性展开了研究。当2-甲基咪唑、醋酸锌和戊二醛的添加量分别为240mmol/L、80mmol/L和50mmol/L时，固定化细胞（ E . coli @ZIF-8-GA）的比活性和活性回收率分别达到33.4U/g和95.83%。结果表明，在重复使用10个批次后， E . coli @ZIF-8-GA转化生产 α -酮戊二酸的产量仍能达到70.03g/L。与游离细胞相比，固定化细胞对温度和pH的耐受性均发生显著提高。
L-谷氨酸氧化酶（LGOX）是以FAD为辅酶的一种黄素酶，因其对反应底物具有高特异性和高亲和力，反应条件温和，从而广泛应用于食品、工业发酵及医药等行业。近年来，通过开展外源表达、发酵优化、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达等研究，拓宽了LGOX在全细胞转化生产α-酮戊二酸中的应用。但仍存在一些不足，其中最为突出的是使用全细胞催化时稳定性较差、难以重复利用。解决上述问题的方法可以分为两大类，一类是采用蛋白质工程方法对酶进行分子改造，另一类是对细胞或酶进行化学修饰或者固定化。
近年来，越来越多的固定化技术被用于生物催化途径，有效地提高了生物催化剂在生产应用中的稳定性。该技术通过把游离细胞或酶通过化学或物理手段固定在限定空间内，以减少外界不良环境对生物体的影响，使其尽可能保持良好的活性，且能被重复和连续使用。如陈孝鹏等以硅藻土为载体，采用聚乙烯亚胺和戊二醛作为交联剂固定重组大肠杆菌，催化合成6-氰基-(3 R ,5 R )-二羟基己酸叔丁酯，在填充床式反应器中可以连续反应5个批次，转化570g/L底物，较游离细胞间歇操作提高了185%。但目前关于固定化技术提高LGOX在生物催化过程中的稳定性相关文献较少，根据已有报道，李力等通过使用海藻酸钠固定含有LGOX的重组大肠杆菌，重复使用50次，相对酶活依然保持在80%以上。该方法提高了重组大肠杆菌的重复使用性，但在使用过程中底物添加量较低，使得 α -酮戊二酸的产量无法满足工业化需求。因此，选择合适的固定化载体来提高生物催化剂的催化效率至关重要。
沸石咪唑骨架（ZIF-8）是近年来兴起的一种新型纳米材料，适用于生物催化剂的固定化。ZIF-8是由Zn 2+ 与2-甲基咪唑配位形成，具有大孔隙率、优异的结构、热稳定性和极低的毒性等优点，为生物催化剂提供了保护，同时包裹的生物催化剂表现出优异的性能，包括极高的稳定性和耐热性。细胞和酶可以在温和条件下被ZIF-8包覆，这对维持其生物活性至关重要。如Sun等使用ZIF-8包裹酵母细胞，使得80%以上的酵母细胞@ZIF-8在纯水中存活一个月以上，相应的游离细胞几乎全部死亡。此外，戊二醛（GA）被广泛用作交联剂，通过胺基和醛基的缩合反应，将酶或细胞固定在含有伯胺基的载体上，形成稳定的仲醛二胺。综上所述，固定化技术可以极大地提高细胞或酶在工业生产中的应用。如能有效提高固定化细胞转化生产 α -酮戊二酸的稳定性及催化效率，降低工艺操作成本，将极大促进固定化技术在生物催化领域的深入研究和广泛应用。
本文报道了一种将ZIF-8和GA结合的组合固定化策略，在ZIF-8的前体溶液中加入重组大肠杆菌和戊二醛交联剂，通过共沉淀法进行固定化细胞的制备，与常用的固定化细胞方法展开了对比。确定了 E . coli @ZIF-8-GA的工艺条件，并对其开展了表征分析以及催化性能的探究。此外，还探索了ZIF-8应用于固定化LGOX酶的可行性，优化了固定化酶的制备方法，研究了固定化酶的稳定性，为LGOX工业化应用提供了可能性。
1
材料和方法
1.1
主要材料与菌株
α -酮戊二酸（＞95%，Sigma公司）、戊二醛、聚乙烯醇、琼脂、海藻酸钠、硅藻土、活性炭、罗丹明B、硫氰化钾滴定液（国药集团）、7-氨基放线菌素、L-谷氨酸钠、2-甲基咪唑、乙酸锌、聚天冬氨酸（＞95%，阿拉丁试剂有限公司）。
实验菌株BL21(DE3)/pET28a-LGOX由本文作者课题组实验室构建并保藏。
1.2
仪器
流式细胞仪，Accuri C6 Plus，美国碧迪公司；X-射线衍射仪，D8，德国布鲁克公司；傅里叶红外光谱，TENSOR Ⅱ，德国布鲁克公司；X-射线电子能谱仪，Axis supra，英国Kratos公司；扫描电子显微镜，Quanta 200，美国赛默飞公司；多功能酶标仪，H1，美国BIOTEK公司；高压细胞破碎机，UH-06，上海永联生物科技有限公司；高速离心机，5804R，德国艾本德公司。
1 .3
实验方法
1.3.1 固定化细胞的制备
海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂的固定化方法见参考文献。
硅藻土-戊二醛：取0.5g湿细胞溶于10mL 磷酸缓冲盐溶液（PBS）中（pH 7，0.1mol/L）配成菌悬液。先加入0.3g硅藻土，搅拌30min；然后加入50mmol/L戊二醛，搅拌30min；过滤回收。
活性炭-戊二醛：取1.5g活性炭于10mL PBS中，加入0.5g湿细胞，搅拌20min；随后加入50mmol/L的戊二醛溶液，搅拌10min；过滤回收。
ZIF-8：取240mmol/L的2-甲基咪唑溶于10mL去离子水，用乙酸调至pH=7.0。将0.5g湿细胞溶于2-甲基咪唑溶液中，搅拌10min；之后加入10mL的乙酸锌（80mmol/L）溶液，静置30min；过滤回收。
ZIF-8-戊二醛：取240mmol/L的2-甲基咪唑溶于10mL去离子水，用乙酸调至pH=7.0。将0.5g湿细胞溶于2-甲基咪唑溶液中，搅拌10min；加入50mmol/L的戊二醛溶液，搅拌10min；之后加入10mL的乙酸锌（80mmol/L）溶液，静置30min；过滤回收。
1.3.2 固定化细胞分析方法
固定化细胞进行 α -酮戊二酸转化实验：称取20g/L的游离细胞以及相对应的固定化细胞溶于PBS中（pH 7、0.1mol/L），加入100g/L L-谷氨酸钠，转化时间16h、温度30℃。
α-酮戊二酸的高效液相色谱检测方法如下。
样品的处理：取转化液1mL，12000r/min离心10min，将上清液稀释至适当的倍数，经过0.22μm滤膜过滤后供液相色谱分析。
流动相配制：取275μL浓硫酸于900mL超纯水中，并用超纯水定容至1L，稀硫酸流动相终浓度为5mmol/L。
α-酮戊二酸的测定：采用液相色谱柱（Aminex HPX-87H，300×7.8mm）；流动相流速为0.6mL/min；柱温35℃，检测波长210nm。
固定化细胞LGOX酶活测定根据已报道的参考文献,1，做了一定修改。方法如下：LGOX酶活性测定通过Trinder反应（4-氨基安替比林体系）测定，反应体系中包含：121.4μL/mL 4-氨基安替比林1.0mL，0.26μL/mL N , N -二甲基苯胺1.4mL，60U/L过氧化物酶0.1mL，11mg/mL L-谷氨酸0.5mL。添加适量固定化细胞后精确反应10min，过滤取上清液。在550nm下测定吸光值。LGOX酶活定义为每分钟产生1μmol H 2 O 2 所需的酶量即为1U的酶活，用式(1)计算。
式中， A 550 为550nm下吸光值；14.3为每毫摩尔（mmol）亚胺物质的吸光值；3.0为反应体系总体积，mL；10为反应时间，min。本文用LGOX的酶活性表示固定化细胞的活性。
固定化细胞的比活力、活性回收率用式(2)、式(3)计算。
式中， A i 为固定化细胞中LGOX的酶活； A s 为游离细胞在固定化前LGOX的酶活； m i 为添加的固定化细胞干重，g。
重复批次中锌离子检测实验：于10mL试管中，依次加入100μL的Zn(Ⅱ)标准溶液（10μg/mL）或不同批次转化后的上清液、1.3mL的2mol/L硫氰化钾（KSCN）溶液、1.2mL乙酸-乙酸钠（HAc-NaAc）溶液（pH=5.5）和0.8mL的0.1g/L罗丹明B（RhB）溶液，用超纯水定容至5mL，反应时间5min。以超纯水为空白对照，取适量试液在最大波长555nm处分别测定其吸光度 A 555 nm。
1.3.3 固定化细胞的表征方法
样品的干燥：游离细胞和固定化细胞用pH 7.0、100mmol/L PBS缓冲液洗涤，在体积分数2% GA中保存8h，以固定样品。然后，用100mmol/L PBS缓冲液清洗样品以去除GA，在50%~90%的乙醇溶液中逐级脱水20min。脱水后自然晾干至恒重。
样品的染色：游离细胞和固定化细胞用pH 7.0、100mmol/L PBS缓冲液洗涤3次，加入7-氨基放线菌素或碘化丙啶10μL，避光染色20min，之后使用PBS缓冲液清洗3次，用于流式细胞仪检测。
检测方法：使用流式细胞仪分析材料对细胞活性的影响。使用傅里叶红外光谱分析结构组成，扫描范围为400～3000cm -1 。使用X-射线衍射对样品定性分析，扫描范围为5°～40°，扫描时间为0.02s。使用X-射线电子能谱图分析样品的元素组成。使用扫描电镜分析样品形貌。
1.3.4 固定化酶的制备
将2mg的LGOX（0.04 U）分散到1mL不同浓度的聚天冬氨酸（PASP）水溶液（1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL和50mg/mL）。然后将溶液搅拌10s，然后依次加入2mL 2-甲基咪唑溶液（240mmol/L）和2mL乙酸锌溶液（40mmol/L）。将混合物静置4h，离心3次以去除松散吸附的蛋白质。此外，将1mL PASP溶液替换为1mL去离子水，并将形成的复合材料用作对照。
1.3.5 固定化酶的检测方法
酶浓度测定：采用考马斯亮蓝法测定酶浓度。配制不同浓度的牛血清蛋白，测定样品在595nm处的吸光值，绘制标准曲线。将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度，取10μL样品，加入300μL考马斯亮蓝G250染色液，混匀后放置5~10min，根据测得的吸光值，计算样品酶浓度。吸附率计算公式见式(4)。
式中， W 1 表示固定化前上清液酶浓度； W 2 表示固定化后上清液酶浓度。
1.3.6 固定化酶催化耐久性实验
固定化LGOX酶进行 α -KG转化实验：称 取20g/L固定化酶溶于100mL PBS中（pH 7、0.1mol/L），分别加入1mL过氧化氢酶和100g/L L-谷氨酸钠，转化时间16h，温度30℃。反应后离心收集固定化酶，pH 7.0、100mmol/LPBS缓冲液洗涤3次，测量固定化酶的酶活性。相对活性计算公式见式(5)。
式中， W 3 表示反应前酶的活性； W 4 表示反应后酶的活性。
固定化酶的LGOX酶活测定与固定化细胞（1.3.2节）相同。
游离酶LGOX的酶活测定见参考文献。
2
结果与讨论
2.1
不同载体对固定化细胞活性的影响
6种不同固体化材料（ZIF-8-GA、聚乙烯醇、琼脂、海藻酸钠、硅藻土-GA、活性炭-GA）对细胞活性的影响如图1所示。游离细胞比活性为46.20U/g，通过海藻酸钠、琼脂和聚乙烯醇等包埋法固定细胞的比活性分别是20.40U/g、21.20U/g和23.10U/g，活性回收率分别为67.23%、63.11%、54.29%。这是由于聚乙烯醇、海藻酸钠和琼脂将细胞包裹在其中，增加了细胞与底物的接触难度。硅藻土和活性炭通过与GA交联-吸附后固定化细胞的比活性仅9.80U/g和10.60U/g，活性回收率均低于20%。这是由于硅藻土和活性炭的物理吸附力较弱。相比之下，ZIF-8固定化细胞的整体效果较好，比活性和活性回收率分别为30.11U/g和85.27%。因为ZIF-8本身具有大孔隙率，覆盖于细胞表面后并未影响细胞的活性。同时通过细胞与GA的结合进一步提高了细胞的活性回收率，ZIF-8-GA固定化细胞的比活性和活性回收率分别达到33.40U/g和95.83%。
图1 不同载体对细胞的比活力和活性回收率的影响
2.2
ZIF-8-GA添加量对固定化细胞活性的影响
不同浓度的2-甲基咪唑对比活力和活性回收率的影响如图2(a)所示。随着2-甲基咪唑浓度的逐渐增加（80~240mmol/L），固定化细胞的活性逐渐增加，在添加量为240mmol/L时固定化细胞的比活力和活性回收率达到最高值33.1U/g和88.75%，而继续增加2-甲基咪唑的浓度（≥240mmol/L）则导致比活力和活性回收率逐渐降低。这是因为高浓度的2-甲基咪唑会导致酶失活，从而影响细胞活性。当乙酸锌浓度达到80mmol/L，形成的ZIF-8效果最好，比活力和活性回收率分别达到33.27U/g和88.34%[图2(b)]。此外，戊二醛浓度为50mmol/L时，比活力和活性回收率分别34.08U/g和95.83%[图2(c)]。由于戊二醛对细胞具有一定毒性，继续增加浓度，则会影响固定化细胞的活性。
图2 固定化参数的优化
2.3
固定化载体的表征分析
2.3.1 X-射线衍射仪和能谱仪观察固定化细胞
E . coli @ZIF-8-GA的固定化原理是通过原位合成的方式将ZIF-8涂层于细胞表面，并通过戊二醛与细胞膜上的氨基交联达到固定的目的。为了验证ZIF-8是否可以涂层于细胞表面，对固定化细胞进行了表征分析。粉末X-射线衍射仪（PXRD）检测结果显示，ZIF-8包裹的细胞在2 θ =7.3°、10.5°、12.5°、14.6°、17.9°、25.5°、26.4°、29.4°处观察到衍射峰[图3(a)]，与ZIF-8的标准PXRD图谱基本一致，表明ZIF-8与细胞的成功结合。之后通过X-射线能谱仪在固定化细胞中检测到Zn元素存在[图3(b)]，进一步证实了ZIF-8的存在。
图3 固定化细胞PXRD图和X-射线能谱图
2.3.2 傅里叶红外光谱仪观察固定化细胞
由图4可得，采用傅里叶红外光谱（FTIR）对预合成的材料与固定化细胞进行完整性检测。观察到在420cm -1 出现ZIF-8中具有代表性的Zn—N键的伸缩振动吸收峰，在688cm -1 和758cm -1 处出现咪唑环的平面外弯曲特异吸收峰，在953cm -1 和1308cm -1 处出现咪唑环的平面内弯曲特异吸收峰，这些特异吸收峰与文献中报道的ZIF-8的特异吸收峰基本一致。从官能团方面证明了固定化细胞的成功制备。
图4 固定化细胞的红外谱图
2.3.3 扫描电镜观察固定化细胞的形态
使用扫描电镜（SEM）对固定化细胞的形态进行观察。由图5(b)对比可得，固定化细胞表面沉积有ZIF-8保护壳。此外，游离细胞分布均匀[图5(a)]，在经过ZIF-8涂层和戊二醛交联之后，固定化细胞发生明显的聚集[图5(b)]，这有利于固定化细胞的重复利用。
图5 游离细胞和固定化细胞的扫描电镜图谱
2.4
固定化细胞的催化性能
2.4.1 温度的变化对固定化细胞的影响
温度（20~50℃）对游离细胞和固定化细胞比活性的影响如图6(a)所示。随着温度的升高，游离细胞和固定细胞的比活力于30℃时达到最高值35.1U/g和32.9U/g。继续升高温度（≥35℃），固定化细胞的比活性明显高于游离细胞。不同温度下将固定化细胞和游离细胞孵育16h，测定剩余活性（16h）。由图6(b)可得，30°C时固定化细胞的剩余活性保持在80%以上，游离细胞的剩余活性仅为55%。当温度为50℃时，游离细胞的活性明显下降，16h后固定化细胞的剩余活性比游离细胞高出40%。这是由于ZIF-8本身具有良好的热稳定性，涂层于细胞表面后提高了固定化细胞的耐热性。
图6 固定化细胞和游离细胞的最适温度和耐热性
2.4.2 pH的变化对固定化细胞的影响
pH变化（5.0~9.0）对游离细胞和固定化细胞比活性的影响如图7(a)所示。固定化细胞和游离细胞最适pH均是7.0，比活力达到36.2U/g和33 U/g。而提高溶液的pH时，游离酶比活力迅速下降，而固定化细胞下降速度相对平缓，显示出比游离细胞更宽泛的pH适应性。图7(b)结果表明，在最适pH条件下，固定化细胞剩余活性保持在80%以上，游离细胞仅有50%。当pH为9.0时，固定化细胞的剩余活性保持在40%以上，而游离细胞则不到20%。当pH为5时，固定化细胞的活性发生明显下降，这是因为ZIF-8会在酸性条件下不稳定，从而失去了对细胞的保护。
图7 固定化细胞和游离细胞的最适pH和pH耐受性
2.4.3 操作稳定性
为了探索固定化细胞的工业应用潜力，利用固定化细胞和游离细胞进行α-酮戊二酸转化实验。由图8(a)可得，当游离细胞使用至第三批次时产量仅有50g/L，5批次后，催化能力基本丧失。而固定化细胞在前6个转化批次产量保持在90g/L以上，重复使用至第10个批次时，产量为70.03g/L。相较于游离细胞，固定化细胞的操作稳定性和催化效率发生了明显的提升，进一步提高了含LGOX的重组大肠杆菌转化生产α-酮戊二酸的工业化潜力。此外，为了观察在重复批次过程中ZIF-8的结构稳定性，反应结束后通过Zn(Ⅱ)-SCN-RhB显色反应体系检测上清液中是否含有Zn(Ⅱ)，若反应液中存在Zn(Ⅱ)，会使得体系的吸收峰发生明显下降。这是因为在pH=5.5的HAc-NaAc缓冲溶液和KSCN溶液中，RhB溶液在555nm处有一个强的吸收峰。Zn(Ⅱ)和SCN 2- 形成的Zn(SCN) 4 2- 与RhB在静电引力的作用下结合成离子缔合物，会使体系在555nm处的吸光度随之减少。由图8(b)可得，空白对照的 A 550nm =2.196，当加入Zn(Ⅱ)标准溶液（10μg/mL）后， A 550nm 下降至1.147。而在固定化细胞的连续操作过程中，检测反应结束后上清液的Zn(Ⅱ)含量，发现 A 550nm 均保持在2.150左右，说明上清液中并未存在Zn(Ⅱ)，即反应过程中并未有金属离子的泄露。
图8 固定化细胞和游离细胞的操作稳定性
2.4.4 储藏稳定性
固定化细胞的储藏稳定性也是其工业化应用的一项重要指标。将固定化细胞和游离细胞置于4℃保存，观察14天内细胞活性的变化。由图9可得，固定化细胞在前7天的活性仍能保持在80%左右，相应的游离细胞活性则低于50%。固定化细胞储藏至14天时仍能维持60%的活性，而游离细胞的剩余活性则几乎检测不到。
图9 固定化细胞和游离细胞的储藏稳定性
2.5
ZIF-8固定化LGOX酶
2.5.1 聚天冬氨酸的添加量对固定化酶活性的影响
近年来，越来越多的金属有机框架用于酶的固定化，所形成的固定化酶具有良好的稳定性且便于重复利用。本研究在使用ZIF-8对LGOX进行固定化时，通过对比分析固定前后上清液酶含量，发现固定化酶的酶吸（PASP）增加ZIF-8对酶LGOX的吸附量，可以发现当PASP的添加量为15mg/mL时，固定化酶的吸附率和相对活性分别达到90%和85%，见图10。其原因是PASP修饰的LGOX一方面可以遮盖酶表面的正电荷（通过静电作用），另外PASP表面大量羧基能促进LGOX-ZIF-8复合物的形成。此外，继续增加PASP的浓度，会发现活性发生明显下降。根据相关报道，推测聚天冬氨酸的加入可能会诱导ZIF-8构型的变化，从而影响固定化酶的活性。
图10 PASP的添加对固定化酶吸附率和活性的影响
2.5.2 PASP-ZIF-8的保护效果和催化耐久性
为了评估PASP-ZIF-8对酶LGOX的保护效果，分别将游离酶和固定化酶暴露于胰蛋白酶（5mg/mL）、尿素（5mol/L）和高温（60℃）等条件下，60min后检测游离酶和固定化酶的活性[图11(a)]，发现经过胰蛋白酶、尿素、高温处理后游离酶的相对活性仅为27%、19%、16%，而固定化酶相对活性为87%、74%、81%。进一步对LGOX@PASP-ZIF-8的催化耐久性进行了分析，固定化酶很容易通过离心被回收，检测重复试验中的酶泄漏量均不超过1%[图11(b)]。而重复使用10个批次，固定化酶的相对活性始终保持90%以上[图11(c)]。由此可见，使用PASP-ZIF-8包裹酶更有利于活性的保存，该固定化策略也提高了酶催化生产 α -酮戊二酸的应用潜力。
图11 ZIF-8对LGOX的保护效果和固定化酶的操作稳定性
3
结论
（1）本研究设计的ZIF-8-GA载体，结构稳定且机械强度较高，给予含LGOX的重组大肠杆菌有效地保护，显著增强了全细胞催化剂的稳定性。进一步通过FTIR、PXRD和SEM检测证明ZIF-8-GA与细胞的正确结合。
（2）在一定的温度（20~50℃）)和pH（5.0~9.0）范围内， E . coli @ZIF-8-GA均显示出比游离细胞更好的稳定性，同时固定化细胞在4℃具有更好的储藏稳定性，表明 E . coli @ZIF-8-GA相较于游离细胞具有更为宽广的适用范围。
（3）在最优条件下（30℃、pH 7.0）， E . coli @ZIF-8-GA可重复催化100g/L L-谷氨酸10批次， α -酮戊二酸产量≥70g/L，解决了表达LGOX的重组大肠杆菌在全细胞催化过程中稳定性较差的问题；并在连续操作过程中，未发现金属离子的泄露，说明ZIF-8保持了良好的结构稳定性。
（4）通过引入聚天冬氨酸，提高了固定化酶的吸附率，并对LGOX提供了良好的保护作用。同时，固定化酶LGOX@PASP-ZIF-8具有良好的催化耐久性，为进一步实际应用奠定了基础。
作者简介 ● ●
第一作者：代静新 ，硕士研究生，研究方向为制药工程。
通信作者：吴静 ，教授，博士生导师，研究方向为微生物与生化药学。
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