脂质纳米颗粒，又一篇Nature Nanotechnology！

在当今医学研究领域，利用 mRNA 作为一种潜在的治疗手段已经引起了广泛的关注和兴趣。传递 mRNA 具有巨大的潜力，可用于治疗和预防多种遗传性疾病、传染病以及其他疾病，为医学领域带来了新的可能性和前景。特别是在过去几年中，通过利用脂质纳米颗粒（LNP）作为载体，将 mRNA 递送至体内，已成为一种备受关注的方法。然而，针对呼吸系统疾病的治疗和预防仍然面临着挑战。在肺部疾病的治疗中，如囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍和哮喘等，传递 mRNA 至呼吸道上皮细胞是一项关键的挑战。此外，寻找更有效的途径，例如黏膜疫苗接种，以增强肺部对呼吸道感染的保护，也是当前医学研究的一个重要方向。

近期的研究表明，尽管 LNPs 作为潜在的 mRNA 递送载体具有巨大的潜力，但在利用雾化途径递送 LNPs 时仍然存在一些挑战。这些挑战包括雾化过程中对纳米颗粒结构的破坏和聚集、穿透黏液层的困难以及难以进入肺上皮细胞的基底侧。

2023年11月20日， 麻省理工学院 通讯作者 Daniel G. Anderson 的团队， 通过优化LNPs的配方、利用ALI培养进行体外筛选以及发现IR-117-17和IR-19-Py等两种优越的LNPs，实现了在呼吸系统中的mRNA递送的显著进展。研究揭示了LNPs在ALI培养中的有效性，并发现了特定的LNP变体，为呼吸道疾病的治疗提供了有前景的可能性，为呼吸系统的mRNA递送提供了一个有效的解决方案 。该研究成果以“Combinatorial development of nebulized mRNA delivery formulations for the lungs”为题，发表在 Nature Nanotechnology 期刊上。论文共同第一作者是麻省理工学院的 Allen Y. Jiang, Jacob Witten 和  Idris O. Raji 。

【LNPs的雾化递送配方优化】

研究使用了设计实验（DOE）方法，旨在优化 LNPs 的稳定性，特别是在雾化过程中的稳定性。初始实验显示，经过雾化后的 LNPs 在 A549 细胞中的体外转染能力下降，mRNA 封装丧失，并且粒径增大。通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）观察到 LNPs 表面出现随机堆叠的层状结构，暗示了雾化过程中可能引起的表面损伤。因此，研究筛选了能够在雾化后保持稳定性的 LNP 配方。

在实验中，通过对离子化脂质、辅助磷脂和胆固醇的摩尔比例、离子化脂质和辅助磷脂的身份等进行变化，制备了包括初始肝靶向配方在内的19种 LNPs 配方。经过评估，发现其中一种配方（T1-5）具有较高的体外转染效率，包裹效率和粒径，且在经历雾化后转染效率和包裹效率未出现明显下降。T1-5 配方中加入的 1,2-二油酰-3-三甲基氨丙基-质子（DOTAP）有助于改善 LNPs 的稳定性，并保持了 LNPs 的形态和 mRNA 封装效率。

随后，研究验证了 T1-5 配方在多次实验中的可重复性，并将其用于体内的荧光素酶（FFL）mRNA递送的评估。结果显示，使用 T1-5 配方递送的肺部荧光素酶活性明显高于使用初始配方 T1-1 的活性。尽管 T1-5 配方在体内表现出良好的递送效果，但在经历雾化后粒径显著增加，这可能影响了其进一步的应用。

图1 | 利用设计实验方法（DOE）对LNPs进行雾化递送的配方优化。

【改善LNP稳定性的辅助剂和缓冲液修改】

首先，研究进行了合理设计的稳定辅助剂和缓冲液的筛选，旨在优化 LNPs 在雾化过程中的稳定性。实验中，研究探究了蔗糖和蔗糖分子的作用，以及多种聚合物（如 Dextran、Ficoll 和不同类型的聚乙二醇）对 LNPs 的稳定性影响。发现加入 bPEG20K 聚乙二醇可以显著提高 LNPs 的肺部递送效能，而 bPEG20K 对 LNPs 的表现影响主要与其在配方中的存在相关。

为了提高雾化时小鼠的均匀暴露于气溶胶的可能性，研究采用了个体限制器并将小鼠连接到鼻部曝露系统。与全身曝露相比，该系统导致肺部荧光素酶活性显著增加，因此该鼻部曝露系统被采用用于后续实验。

此外，研究比较了两种不同的雾化缓冲液（0.9%的氯化钠和100 mM 的醋酸钠）与 PBS 的效果。结果表明，醋酸钠缓冲液能够显著提高 LNPs 的雾化递送效能，增加 LNPs 的 zeta 电位，减少 LNPs 在雾化过程中的聚集。最后，研究发现加入 bPEG20K 和醋酸钠缓冲液的组合不仅可以减少 LNPs 在雾化过程中的粒径增加，还能保护 mRNA 免受雾化过程中的破裂，提高 LNPs 在体内递送的效能。因此，在随后的体内实验中，使用了经醋酸钠缓冲液二次分离和添加2% w/v 的 bPEG20K 辅助剂的 LNPs。

图2 | 辅助剂和缓冲液修改以改善LNP稳定性和体内递送。

【生物可降解脂质库的合成和筛选】

首先，研究设计了一种生物可降解脂质的合成策略，采用还原胺基化化学方法，将含酯的脂质醛与胺基化合物反应（见图3a）。在合成过程中，经过薄层色谱法估计，典型的转化率在纯化前约为50-80%。为了测试是否可以像对其他脂质库一样，无需单独纯化即可对脂质进行筛选，研究制备了22种脂质，包括纯化和未纯化的脂质，并使用 T1-5 配方制备成 LNPs，测试它们在 A549 细胞中对 FFL mRNA 的传递效果。因此，研究限制了使用一个较小的脂质库，该库结合了多种头基和一组有限的尾基，认为可以在后续步骤中优化尾基结构。研究预测不饱和的尾基会具有最佳的活性，因此主要合成了具有油酸和亚油酸尾基的脂质（见图3b），尽管也合成了四种具有C16尾基的脂质。在C16尾基脂质中，四分之三的脂质效果不如与其头基匹配的不饱和尾基变体，而第四种脂质在活性上不在前20种脂质之列，初步验证了对不饱和尾基的关注。

图3 | 生物可降解脂质库的合成和筛选。

【在ALI培养中进行可离子化脂质筛选】

利用初级人支气管上皮细胞 ALI 培养作为体外模型，用于筛选并评估 LNPs 在呼吸系统中的 mRNA 递送效果。ALI 培养通过模拟体内支气管上皮的关键特征，如细胞分化、黏液分泌和紧密连接，提供了更接近真实生理条件的细胞环境。然而，由于其类似体内特性，ALI 培养对于传递 LNPs 等物质的转染效率较低，这使其成为一个有潜力的模型用于筛选 LNPs。

研究人员首先创建了大气道和小气道的 ALI 培养模型，模拟了两种重要的呼吸道类型，这些培养模型展现了与体内相似的生理特征，如形成紧密连接和浓密的纤毛。通过将 LNPs 在 ALI 培养中对 FFLMRNA 的递送效果进行测试，研究发现随着培养时间的延长，转染效率下降，这与先前观察到的传统细胞培养技术在 ALI 培养的第一周内降低的情况相一致，这可能是由于细胞的分化和形成紧密连接等因素导致的。接下来，研究对表现最佳的 LNPs 进行了更深入的筛选，并发现了两种 LNPs，即 A10-Lin/IR-117-17 和 A20-Ol/IR-19-Py，它们在 ALI 培养中展现出良好的 mRNA 递送效果。研究人员还针对 IR-117-17 和 IR-19-Py 进行了结构变体的测试，发现不饱和尾基和头基的特定变化会影响 LNPs 的递送效果。

【主要可离子化脂质LNPs的体内评估】

研究通过雾化实验和ALI培养的技术验证LNPs的效能。结果显示，其中一个名为IR-117-17的LNP在小鼠中实现了优异的肺部递送效果，高于其他已有的传递技术。然而，ALI培养试验中的预测结果与实际体内数据之间存在一定差异，表明这种培养技术不能完全预测LNPs在体内的行为。研究人员还发现对LNPs进行雾化处理后，ALI培养和A549细胞的实验数据与体内数据之间存在更强的相关性。最后，通过对新型LNPs的化学特性和递送效能进行深入分析，他们确定了IR-117-17和IR-19-Py作为领先的LNPs，并优化了LNPs的配方和制备工艺，以提高其递送效果和稳定性。

图4 | 高效脂质的体内测试和体内外比较。

【顶级LNPs的药代动力学和药效学】

通过雾化剂量反应实验，确定了C12-200、IR-117-17和IR-19-Py三种LNPs的剂量与肺部蛋白表达的相关性。随后进行了时间研究，发现肺部和鼻部的蛋白表达在某些情况下持续时间长达48小时，IR-19-Py在鼻腔表达持续时间更长，这表明它可能适用于鼻腔疫苗。为了治疗肺部疾病，例如囊性纤维化，需要重复给药。因此，研究人员对LNPs进行了重复给药的特性分析，发现每隔72小时雾化给药1毫克FFL mRNA时，所有LNPs在三次给药期间肺部荧光素信号没有降低。对IR-117-17进行酯酶裂解代谢物的研究表明，它可以通过酯酶的降解而不会在重复给药时积累。此外，在小鼠模型中进行了肺部疾病的相关性评估，结果表明IR-117-17 LNPs在CF模型中呈现出高效的mRNA传递能力，即使在CF样肺部疾病的情况下也能实现。

图5 | 表现最佳LNPs的药代动力学和药效学。

【使用IR-117-17 LNPs定量细胞转染】

对Ai14小鼠模型实验，通过测试IR-117-17 LNPs或hPBAEs给予的Cre重组酶mRNA的雾化递送来定量特定细胞类型的转染。实验显示，IR-117-17在大气道和小气道细胞转染方面表现出比hPBAE显著增加的效果，分别达到了45倍和4.6倍。此外，针对肺中最主要的CFTR来源之一——club细胞的转染率稍低，但IR-117-17 LNPs的转染效率仍然明显优于hPBAE。研究还指出IR-117-17 LNPs和hPBAE在转染其他细胞类型（如肺泡巨噬细胞和肺泡上皮）方面的差异。此外，对于LNPs处理的小鼠，所有21个大气道和151个小气道中的140个（93%）至少有一个转染细胞。部分气道呈现了近乎完全的转染，而这种转染的异质性可能由于转染性和/或颗粒沉积的差异所致，这是未来研究的一个有趣方向。

图6 | 在Ai14小鼠模型中评估IR-117-17 LNPs对肺上皮细胞的功能性mRNA递送。

【小结】

该研究提出了一种全新的肺部mRNA递送策略，通过优化脂质纳米粒的配方和缓冲剂，发现了IR-117-17和IR-19-Py这两种新型配方，这些配方在体内外试验中表现出卓越的效果。IR-117-17特别突出，为治疗非肺泡区域疾病提供了更有希望的可能性。此外，研究还验证了这些新型LNP在不同动物模型中的有效性和安全性，为未来肺部疾病的治疗提供了全新的方向和策略。