科研 | Nature子刊（IF：10.302）：在生物土壤结皮中，水驱动的微生物氮转化导致大气中亚硝酸和一氧化氮的排放

实验设计图

图1 实验装置概述。（a）用于测量活性氮（N _r ）通量的室内动态系统；（b）干燥循环中三个阶段的代表性排放曲线/模式（T1：早期湿润；~99%平均持水能力（WHC）；T2：中间干燥~30%平均WHC；T3：后期干燥~4%平均WHC）。在每个阶段，停止动态室内测量，并进行微阵列、宏蛋白质组学和CARD FISH分析（后者仅在T1和T2阶段使用）。

图2 沿干燥循环的活性氮排放。（a）干燥过程中的不同阶段（T2，T3）来自南非的蓝细菌为主的生物结皮（25°C，黑暗条件下）沿干燥循环的平均HONO和NO排放曲线。线表示平均通量和阴影区域，即标准偏差；（b）比较干燥过程中不同阶段（T2、T3）停止测量的最大HONO和NO排放量，以及（c）HONO和NO综合排放量。T2时，样本的平均WHC约为30%，T3时为4%；n=3。

在完全干燥循环之前，生物结皮的NO ₂ ^- -N和NO ₃ ^- -N含量与处理过的CH ₃ I和对照样品中的NO ₂ ^- -N和NO ₃ ^- -N含量相似 （图3）。经过干燥循环后，对照样品的氮含量往往更高，NO ₂ ^- -N含量显著增加（ q =6.607， p =0.007，N=3；图3a；表S1c）。经CH ₃ I处理的样品NO ₂ ^- -N和NO ₃ ^- -N含量较低，这与干燥试验前分析的样品的含量相似（图3a）。

图3 不同采样时间和不同土层中的营养物含量、氧饱和度和细胞数。（a）在干燥循环之前和之后，对照和碘甲烷（CH ₃ I）处理组样品中的亚硝酸盐和硝酸盐含量。误差棒表示标准差，不同字母表示差异的显著性（单向方差分析和事后检验， p <0.01，n=3）；atro代表绝对干燥。（b）生物结皮样品中上层（光自养层；0-400 µm）和下层（异养层，>400-3000 µm）在T1（99%WHC）和T2（30%WHC）处的平均氧饱和度（%）。条形代表平均值，误差条代表标准差（n=8）。双向重复检验ANOVA和事后检验（ p <0.05）的结果以字母形式显示在条形图的顶部。（c）在生物结皮上层和下层干燥过程中，在第1和第2阶段检测到的每1克土壤中CARD FISH染色细菌（EUB）、古菌和亚硝酸盐氧化细菌（NOB）的细胞数。条形图代表每个生物结皮样本过滤截面上1000个细胞计数的平均值。误差条表示标准差（n=3）。用于解释伪重复（后验概率<0.05）的贝叶斯层次模型的结果以字母的形式给出。

在57000个探针中，平均27.6%的探针实现了cDNA杂交（表S3），表明该程序工作正常。13%具有阳性杂交信号的探针可分配到N转化过程类别（表S3）。同时测定了 编码固氮、氨化、硝化、反硝化、厌氧氨氧化、异化硝酸盐还原（DNRA）和同化硝酸盐还原的酶基因的mRNA转录子。 分层聚类（图S2、S3）和非度量多维尺度分析表明，干燥过程中三个阶段的基因表达明显不同（图4b），同一阶段的样本比不同阶段的样本更相似。相似性分析（ANOSIM）检验支持以下结论：三个干燥阶段之间的代谢潜力在统计学上是不同的（ANOSIM检验 r=0.876， p =0.003，n=3，置换次数9999）。样品之间检测探针的重叠情况如表S4和S5所示。

图4 N循环示意图和功能基因微阵列数据分析。（a）生物地球化学N循环：功能基因微阵列显示了N转化过程和催化N循环反应的编码基因。（b）干燥过程中不同阶段确定的功能基因图谱的Bray-Curtis相似性的非度量多维标度（NMDS）。图（c，d）是在生物结皮干燥循环的不同阶段检测到的每个N转化过程/基因的信号强度。干燥期间每个阶段三次重复的平均值用来计算标准偏差。干燥阶段之间的差异用单向方差分析进行检验，并用小写字母标记。在（d）中，信号强度通过阵列上每个基因的探针数量标准化来计算。T2时高于柱子的数字表示T1和T2之间的百分比增加，T3时高于柱子的数字表示T2和T3之间的百分比增加。1：固定；2：反硝化；3：氨化；4：硝化作用；5：异化氮还原；6：厌氧氨氧化；7：放线菌门、厚壁菌门、蓝藻门、拟杆菌门、螺旋体门、广古菌门和变形菌门内的同化氮还原（e）氮转化微生物。绘制了5个以上分类群的菌科。有关已鉴定生物体的完整列表，请参见表S7。

生物结皮样本包含一个转录物种库（mRNA），涉及氮循环的主要途径，表明微生物对不同的氮转化有贡献（图4c）。检测到的mRNAs数量差异很大，从0-400不等，在 nifH 中观察到的数量最多，而编码硝化酶和厌氧氨氧化酶的基因数量尤其少（图S4）。在干燥循环期间，我们观察到了代谢的快速恢复，在T1，湿润后20-30分钟，参与所有主要N转化过程的基因被诱导（图4c，d）。对于大多数过程，除了 anammox （图4c），功能基因的mRNA水平随着时间的推移而增加。对于固氮（ nifH ）和氨化（ ureC ），基因表达均匀的增加。反硝化和同化氮的减少在第一阶段（从T1到T2）表现出更强的增加趋势，而异化硝酸盐还原为氨（DNRA）在干燥循环的第二阶段（从T2到T3）表现出更强的增加趋势（图4d）。

从T1到T2（320和366种）以及从T2到T3（410种；图4e），N转化物种的数量显著增加。在更高的分类水平上，也可以观察到这种总体增加的现象（表S6）。在干燥循环中，大部分代谢活性细菌属于α和γ变形菌。生物结皮中参与氮循环的类群数量在许多细菌科（介于大约5-15之间）中非常相似，但也有一些科提供了大量类群，例如红杆菌科、慢生根瘤菌科、肠杆菌科和假单胞菌科（图4e）。

结果 表明重氮营养能力的 nifH 基因在系统发育上广泛存在，而在广古菌、厚壁菌、蓝细菌和α变形菌中尤其丰富 （图5）。与其他检测到的重氮营养菌相比，甲烷规则菌科、甲烷微菌科、梭菌科、脱硫菌科和红杆菌科的固氮开始需要更长的恢复期（图5、S5）。潜在的硝化活性是由于古菌和 Betaproteobacteria 的过量活动。最丰富的反硝化菌属于拟杆菌门、放线菌门和变形菌门。氨化基因广泛分布于古菌、细菌和真核生物的各个领域，信号强度的最高值（对于 ureC ）在干燥循环中增加，被观察到在那些属于红杆菌科，链霉菌科、肠杆菌科的生物群中（图S6）。

图5 功能基因微阵列。（a，b）N循环基因的分类群功能关系。图中显示了平均归一化信号强度。白色表示未检测到的信号，而正信号的强度大小由蓝色（较低的信号强度）到红色（较高的信号强度）表示。未分类的细菌未显示。

比较微阵列图谱，以确定干燥循环过程中基因表达的变化。 在2569个测试探针中，221个探针的转录水平在干燥过程中发生了显著变化（图6a，c，e，g）。在这221个探针中，一些在几个阶段表达，另一些仅在一个时间点检测到。随着检测探针数量的增加，分别在T1、T2和T3检测到7个（3.2%）、16个（7.2%）和79个（35.7%）（图6a，c，e）。分析还显示，在T2和T3期间诱导的基因之间存在强烈重叠，因为在T2和T3处检测到99个探针（44.8%），但在T1处未检测到（图6g）。在T3（图6e）或T2和T3（图6g）处表达的基因中，存在编码所有所研究的N转化过程的探针。相比之下，没有编码硝化、硝化和厌氧氨氧化的基因在T1处完全表达，编码硝化和氮还原过程的基因在T2处不完全表达（图6a，c）。随着干燥的进行，不同的细菌变得活跃，细菌科的数量趋于增加（图6b、d、f、h）。总之，在T1阶段只有少数几个独特检测到的细菌科，而T2和T3的分类多样性显示出大幅增加的趋势。

图6 功能基因微阵列。a，c，e，每个基因仅在a T1、c T2、e T3、g T2和T3检测到的探针数量。b，d，f，h，在b T1、d T2、f T3以及h T2和T3检测到的科分类水平上，每个基因检测到的探针的分类群。Ar：古菌；Act：放线菌；Bac：拟杆菌；Cya：蓝细菌；Euk：真核生物；Fir：厚壁菌；Len：黏胶球形菌；Pla：浮霉菌；Alp：α变形菌；Bet：β变形菌；Gam：γ变形菌；Del：δ变形菌；Eps：ε变形菌；Spi：螺旋体；Ver：疣微菌。N fifixation：固氮；dissim. N reduction：异化硝酸盐还原；assim. N reduction：同化硝酸盐还原。

T1、T2和T3分别鉴定了总共60、42和44个蛋白组。与T2和T3（3.4%）相比，T1和T2（18.6%）之间的蛋白质有更大的共享部分，而所有3个阶段之间的共享蛋白质有6.4%（图S7a）。在考虑主要蛋白质时，鉴定的肽的数量最多，88%的鉴定蛋白质属于细菌种类（主要是蓝细菌和α变形菌），而剩余的蛋白质来自真核生物（真菌和原生生物）（补充材料2）。蛋白质根据基因本体术语进行分类。大多数确定的蛋白质组与ATP合成、光合作用、蛋白质生物合成和应激反应有关（图S7b-e）。一些类别，比如ATP合成，碳水化合物代谢和蛋白质生物合成与T1和T2相比，T3中的此类蛋白质数量较少，而参与脂肪酸代谢和光合作用的蛋白质数量较高。与应激反应相关的蛋白质组，如在应激条件下（例如干燥）产生的伴生物，在T1和T3出现的数量比T2多（图S7）。已鉴定的蛋白质及其分类在补充材料2中给出。与N转化相关的蛋白质无法鉴定。