2023
年
12
月
6
日，华东师范大学陈益华
/
易正芳教授团队合作在国际药物化学权威期刊《
Journal of Medicinal Chemistry
》在线发表了最新研究成果
“
Discovery of a Highly Potent and Selective MYOF Inhibitor with Improved
Water Solubility for the Treatment of Gastric Cance
r”
。这是相关合作团队在前期研究结果（
Nat Commun 2018
；
J Med Chem 2019
;
Clin Transl Med 2021
和
Future Med Chem 2022
）基础上在
MYOF
抑制剂研究领域又一次取得进展。
MYOF
作为
ferlin
家族中的一员，因其在肿瘤中的相关功能而引起了科研人员的兴趣。在快速增殖的癌细胞中，
MYOF
可以通过介导的囊泡运输进而调控细胞间物质交换，细胞内蛋白质的分泌以及蛋白质的再循环和降解等过程，从而进一步调节癌细胞的生长，增殖和迁移等生理过程。然而，由于MYOF晶体结构还未被揭示，
目前报道的
MYOF
抑制剂数量极其有限且均存在水溶性差的缺陷；此外，
MYOF
抑制剂在胃癌领域的研究目前处于一片空白。因此，该合作团队决定在前期研究结果基础上进一步优化提升
MYOF
抑制剂的水溶性并探究其在胃癌中的治疗疗效。
化合物的溶解不仅对物质的消散或液化至关重要而且对达到预期治疗效果所需的全身循环药物的最佳浓度是一个及其关键的因素。据估计，市场上销售的药物中约有
40%
和先导化合物中的
70%
以上存在水溶性较差的问题。溶解度差可能导致多种研究问题，如低响应率，
SAR
关系复杂，低吸收和较差的口服生物利用度等。候选药物的低溶解度阻碍了从
Hit
鉴定到临床前毒性评估阶段的整个药物发现过程。所以，在先导化合物的鉴定初期改善化合物的水溶性有利于节省整个药物研发的周期和经济成本。
SAR
探究和水溶性测试
在抑制剂结构优化中，作者基于已有的工作基础和计算机辅助药物设计策略对化合物结构进行整体分析：对尾部的关键活性官能团苯丁基酰胺链中的苯基和链进行探究以期在保持活性的同时提高其水溶性；同时对处于溶剂暴露区的甲氧基嘧啶官能团进行构效关系探究以调节提升化合物的抗肿瘤活性（图
1A
）。基于以上结构优化策略，作者合成了以
HJ445A
为代表的一系列尾部包含不同数目和取代位置的氮原子的五元杂环的新型
MYOF
抑制剂。随后，对该系列
MYOF
抑制剂进行多项包括水溶性测试的生物活性评估。结果显示，
相比于先导化合物
6y （
J Med Chem
2019）,
以
HJ445A
为代表的该类抑制剂在不同
pH
条件下，水溶性具有上百倍的提升
(
图
2)
。
图
1
：新型
MYOF
抑制剂的结构优化策略及课题设计思路
图
2
：
HJ445A
等新型
MYOF
抑制剂的水溶性测试
HJ445A
对
MYOF
的靶向性和选择性验证
为了验证
HJ445A
和
MYOF
的靶向结合，作者首先通过热漂移实验测定了
HJ445A
对
MYOF
蛋白的热稳定性的贡献。结果显示，
HJ445A
显著提升了
MYOF
蛋白在
51-56℃
之间的热稳定性，这表明
HJ445A
和
MYOF
蛋白的直接结合（图
3A
）。随后
SPR
实验证实
HJ445A
以
0.17μM
的效力和
MYOF-C2D
结构域结合
(
图
3B)
。
Docking
对接结果显示，
HJ445A
中的末端三唑环被埋在
MYOF
蛋白表面的一个结合口袋中，末端三唑环上的氮原子与氨基酸
Ile1231
形成额外的氢键相互作用。酰胺上的
O
原子与
Lys1210
中相邻的氨基酸残基形成了氢键相互作用。乙基末端占据一个狭窄的腔隙，与
Phe1232
、
Hid1251 (His1251
的质子化状态
)
、
Thr1266
和
Ala1267
形成强疏水相互作用。而
HJ445A
底部苯环部分处于溶剂暴露区，这可能是对
B
环进行修饰后抗肿瘤活性没有明显提高的原因
(
图
3C,3D)
。
图
3
：
HJ445A
和
MYOF
的靶向性结合
HJ445A
的选择性实验中，
MYOF
敲后
HJ445A
几乎丧失了对胃癌细胞的敏感性，这表明
HJ445A
对
MYOF
蛋白的依赖性（图
4A-C
）。随后
HJ445A
对更多含有
MYOF
不同表达程度的胃癌细胞和其他癌系的肿瘤细胞的抑制作用表明
HJ445A
的
MYOF
高表达的高度选择性（大于
10
倍）
(
图
4D-I)
。
图
4
：
HJ445A
对
MYOF
的选择性探究
HJ445A
浓度依赖的抑制胃癌细胞的克隆形成和迁移并促进其凋亡
随后，克隆形成实验表明：和
MYOF
敲低实验类似，
HJ445A
能浓度依赖性的抑制胃癌细胞的克隆形成，潜在的机制表明这可能是因为
HJ445A
抑制了
AKT
信号通路的磷酸化的结果。抗迁移实验表明
HJ445A
显著的抑制胃癌细胞的迁移，机制研究表明这可能是
HJ445A
上调
E-Cadherin,
下调
Vimentin
、
N-Cadherin
进而逆转
EMT
过程的结果。凋亡实验表明
HJ445A
分别在
0
、
0.1
、
0.2
、
0.4
、
0.8 μM
时促进胃癌细胞的凋亡率分别为
3.1
、
3.4
、
5.7
、
50.2
、
54.0%
，具有良好的促凋亡作用。
HJ445A
的
ADME
属性评估
药物对
CYP450
酶的抑制可能是药物
-
药物相互作用所致毒性的原因。因此，作者探究了
HJ445A
对
5
种主要
CYP450
同工酶的抑制作用。结果显示，
HJ445A
以
14.7
和
18.8 μM
的
IC
50
值轻度抑制
CYP 2C9
和
CYP 2C19
。此外，
HJ445A
对
CYP 1A2
和
CYP 2D6
和
CYP 3A4
的几乎没有抑制作用，这表明
HJ445A
引起药物
-
药物相互作用的可能性较小（
Table 5
）。随后，作者进一步进行了
hERG
实验来评估化合物
HJ445A
的心脏安全性。结果表明，在
hERG
实验中，
HJ445A
的
IC
50
值大于
40.0 μM
，表明其具有良好的心脏安全性（
Table 6
）。随后，体内的
PK
数据显示在
10 mg/kg
剂量下，
HJ445A
的
C
max
为
5821 ng·mL
-1
，较
6y
提高了
6
倍。静脉给药和口服时，
HJ445A
的
AUC
0-inf
分别为
762
、
4942 h·ng·mL
-1
，分别提高了
2
、
6
倍。
HJ445A
和
6y
静脉给药后的
T
1/2
相等，口服给药后
6y
的
T
1/2
较长可能是其水溶性差导致吸收不良的原因。值得注意的是，与
6y
相比，
HJ445A
的口服生物利用度提升了
5
倍
(65% vs 13%)
。简而言之，
溶解度的改善促进了
HJ445APK
性质的提升
（图
5
）。
图
5
：
HJ445A
和
6y
的
PK
属性探究
HJ445A
的体内药效评估
最后作者通过移植瘤模型研究
HJ445A
在体内的抗肿瘤作用。以胃癌一线化疗药物
5-
氟尿嘧啶和靶向
MYOF
的先导化合物
6y
作为阳性对照。肿瘤生长曲线表明，一线胃癌治疗药物
5-
氟尿嘧啶
(15 mg/kg/d)
对肿瘤生长的抑制率为
39.2%
，
6y
(30 mg/kg/d)
对肿瘤生长的抑制率为
52.2%
。相比之下，当
HJ445A
分别以
15 mg/kg/d
和
30
mg/kg/d
给药时，
TGI
值分别为
55.1%
和
68.5%
，
HJ445A
显示出比
5-Fu
尿嘧啶和
6y
更高的肿瘤抑制率。此外，小鼠体重无显著差异，
HE
染色结果表明，心肝脾肺肾组织未观察到明显变化，这表明即使在
30 mg/kg/d
的剂量下，小鼠对
HJ445A
也具有良好的耐受性（图
6A-E
）。
图
6
：
HJ445A
在体内对胃癌抑制探究
总结
该项研究中作者合成了一系列新型的
MYOF
小分子抑制剂，最优化合物
HJ445A
对
MGC803
和
MKN45
胃癌细胞的增殖抑制作用最强，
IC
50
值分别为
0.16
和
0.14 μM
。在靶向性验证中，
HJ445A
以
0.17 μM
的结合效力直接与
MYOF-C2D
结构域结合并对
MYOF
阳性的胃癌细胞具有数十倍的选择性。值得注意的是，与
6y
相比，
HJ445A
的水溶性显著提高，提高了约
170
倍而水溶性的提升进一步促进了
PK
属性的改善。此外，
HJ445A
通过逆转上皮
-
间充质转化
(EMT)
过程阻止胃癌细胞的迁移，并以浓度依赖性方式抑制
MKN45
细胞的集落形成。体内实验显示，相比于一线治疗药物
5-Fu
尿嘧啶和先导化合物
6y
,
HJ445A
还表现出更强的体内抑制肿瘤效果（
TGI = 68.5%
）。这一系列的结果表明
HJ445A
作为新型的靶向
MYOF
的选择性小分子抑制剂，其成药性取得了一定的改善同时为新一代更具有成药性的
MYOF
抑制剂开发提供新的思路。
该文章以华东师范大学陈益华教授和易正芳教授为共同通讯作者，谷海军和张婷为共同第一作者，同时该研究持续获得华东师范大学刘明耀教授的大力支持。
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c01639
