诺奖主编Bertozzi教授ACS Cent. Sci.|细胞外囊泡相关的神经氨酸酶-3介导小胶质细胞非接触依赖的神经元网络重塑

2023年10月31日，斯坦福大学Carolyn R. Bertozzi教授及团队成员在美国化学会旗舰期刊 ACS Central Science 上在线发表以 “Microglia Mediate Contact-Independent Neuronal Network Remodeling via Secreted Neuraminidase‑3 Associated with Extracellular Vesicles”为标题的文章。作者团队主要发现激活后的小胶质细胞会分泌与细胞外囊泡相关的神经氨酸酶-3（Neu3）。Neu3能够通过重塑神经元表面的糖萼（Glycocalyx）“非接触依赖”地破坏神经元网络。具体来说，作者首先观察到炎症刺激会导致NEU3 基因的转录上调，而NEU3基因的敲除则会消除炎症响应下小胶质细胞分泌物的唾液酸酶活性。此外，作者证明了Neu3的产生与小胶质细胞在炎症损伤时的细胞外囊泡分泌相关。最后，他们也证明Neu3对于神经元去唾液酸化以及神经元网络连接的减少是必需的。总得来说，这项工作表明Neu3参与神经元糖萼重塑并导致神经元网络活动异常，进而可能会对帕金森症和阿尔兹海默症等神经炎症疾病产生影响（图1）。

图1.  Neu3介导小胶质细胞神经元网络重塑

首先，他们观察到小胶质细胞分泌物具有唾液酸酶活性，能够使模型细胞系及原代神经元脱唾液酸化。而扎那米韦（Zanamivir）作为一种唾液酸抑制剂，可以抑制这些作用。为了进一步鉴定激活后的小胶质细胞分泌的唾液酸酶种类，他们使用脂多糖（LPS）激活 BV-2 小鼠的小胶质细胞，并利用 qPCR 评估唾液酸酶基因的mRNA表达水平。作者观察到细胞激活后 NEU3基因相比于NEU1 和 NEU4 的上调变化更为显著。基于此，他们对Neu3在神经元去唾液酸化中的作用展开进一步研究。具体来说，他们比较了野生型（WT）以及NEU3基因敲除（KO）后的BV-2小胶质细胞分泌物的唾液酸酶活性。结果表明与野生型相比，NEU3敲除后细胞分泌物的唾液酸酶活性是最弱的。以上结果表明Neu3在激活后小胶质细胞的唾液酸酶活性中发挥着重要的作用（图2）。

图2.  小胶质细胞上调的NEU3对分泌唾液酸酶的活性是必需的

接着，由于Neu3已经被证明是一种外周膜蛋白，且小胶质细胞在激活后会分泌细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）。因此，作者假设Neu3可能与细胞外囊泡的分泌相关。为了探究这一点，作者首先利用试剂盒分离出了EVs，并通过同源重组在内源NEU3基因上插入3×FLAG标签。即通过FLAG信号指征Neu3，CD9或CD81等囊泡标签蛋白指征EVs。他们实验后发现在LPS刺激下，囊泡亚群中的FLAG阳性群明显增加，表明在刺激条件下小胶质细胞的 Neu3 通过 CD9 和 CD81 阳性Evs的特定亚群分泌。为了进一步确认细胞外囊泡中的 Neu3可以调控神经元的唾液酸酶活性，他们用富含或缺乏EVs的小胶质细胞条件培养基处理神经元并观察到与缺乏EVs的组分相比，富含囊泡组分的唾液酸酶活性显著增加。当加入泛唾液酸酶抑制剂DANA进行处理后，唾液酸酶的活性有所降低。另一方面，当使用EVs抑制剂GW4869对囊泡的产生进行抑制，也会降低富含EVs组分的唾液酸酶活性。最后，作者使用膜染料PKH67对囊泡表面进行染色，能够观察到该染料向神经元膜的转移，表明了囊泡与神经元膜的融合。以上结果表明，激活后的小胶质细胞分泌含有 Neu3 的细胞外囊泡，这些囊泡与神经元膜融合并导致去唾液酸化（图3）。

图3.  Neu3与小胶质细胞的细胞外囊泡相关

最后，作者为了研究Neu3的分泌对神经网络整合性的影响，使用膜定位电压敏感荧光团BeRST1对原代神经元进行电压成像，并借助“共享差异”（shared variance）参数定量评估神经网络的连接性。简而言之，神经元的“共享差异”与神经网络的连接性是正相关的。他们分别使用激活后野生型与NEU3基因敲除BV-2小鼠的EVs对神经元网络进行处理，实验发现野生型组的“共享差异”下降了约38%，表明此时神经元网络的连接性受到了破坏。当使用DANA抑制剂进行处理，能够一定程度恢复野生型组的神经元网络，表明这种破坏效果是唾液酸酶所依赖的。此外，他们发现使用EVs抑制剂GW4869同样能够一定程度地恢复神经元网络，同样表明带有Neu3的EVs能够破坏神经元网络的连接性。最后，他们将Neu3的催化活性位点369位的酪氨酸Y突变成苯丙氨酸F（Y369F），得到不具有催化活性的Neu3。他们分别用野生型以及突变后的培养物处理神经元并评估神经网络的连接性。结果表明与Y369F组相比，野生型组的“共享方差”下降了约15%，表明了这种神经元网络的缺失是Neu3所依赖的。而使用DANA抑制剂处理后同样能够消除这种不利影响。综上所述，小胶质细胞激活后产生的与EVs分泌相关的Neu3会对神经元网络的连接性造成破坏（图4）。

图4.  Neu3能够破坏神经元网络的连接性

总而言之，作者提出了Neu3的一种新机制：小胶质细胞通过细胞外囊泡分泌转移Neu3来调节神经元的唾液酸化。这种Neu3介导的重塑一方面会对神经元网络的连接性产生巨大影响，另一方面也为“非接触依赖”的神经元网络调节提供了分子模型。此外，由于唾液酸聚糖是神经炎症和电生理学变化之间的机制桥梁，这项工作也可能为后续神经系统疾病的潜在治疗靶点的发现提供帮助。

特别感谢本篇推送供稿人北京大学陈鹏/樊新元团队的周南博士。

2023年10月27日，中国化学会公布了2022年度中国化学会荣誉会士（Honorary Fellow），斯坦福大学教授、 ACS Central Science  创刊及现任主编Carolyn R. Bertozzi获此殊荣。中国化学会荣誉会士（Honorary Fellow）是中国化学会面向国际著名化学家设立的荣誉称号，授予对中国化学和中国化学会与国际学会间交流做出贡献的国外卓越学者专家。

以下是中国化学会网站对Bertozzi教授的介绍：

Carolyn R. Bertozzi教授是化学生物和糖科学领域的先驱和顶尖科学家。她开创了生物正交化学的领域，成功实现了在生物活体内高效特异的化学标记反应。通过开发化学工具来研究糖生物学，她促进了对癌症、炎症、结核病等疾病的理解，并为干预策略的开发做出了重要贡献。

Carolyn R. Bertozzi教授是美国科学院院士、美国国家医学院院士、美国国家发明家科学院院士。她与中国糖化学生物学领域保持着良好的交流，并培养了多名杰出青年人才，他们在留学归国后在相关领域取得了卓越成就。

ACS Central Science 是ACS最具包容性的交叉学科期刊，发表以化学为中心的多学科领域最前沿，最重要的研究成果。旨在为全球学者提供交流平台，文章即时发表，全球免费获取，作者也无需付费。

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