科研 | 福建农林：根系生长素与真菌和细菌的配合促进土壤干燥下水稻根鞘的形成（国人佳作）

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编译：微科盟鼻涕 ，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

中度土壤干燥（MSD）可以减少水分消耗，促进根鞘形成，提高植物的抗旱性，是一种很有前途的农业技术。内生真菌梨形孢菌（ Piriformospora indica ， P. indica ）生长素产量高，有利于根鞘的形成。然而，在根鞘形成过程中， P. indica 与本地土壤微生物群的整合作用尚不清楚。该研究利用高通量测序和水稻突变体研究了 P. indica 和本地细菌在MSD下水稻根鞘形成中的作用。在MSD条件下，接种 P. indica 后根鞘形成显著增加30%左右，水稻根和 P. indica 根鞘的形成与生长素有关。 在MSD条件下接种 P. indica ，植物根际促生菌芽孢杆菌的丰度在水稻根鞘和根内层显著增加。 此外，接种 P. indic a 可进一步提高生长素高产蜡样芽孢杆菌（ Bacillus cereus ， B. cereus ）的丰度。同时接种 P. indica 和 B. cereus 后，野生型或补充生长素输出载体 OsPIN2 水稻根鞘形成率高于 ospin2 突变体。综上所述， 在MSD条件下， P. indica 与本地土壤细菌 B. cereus 的相互作用有利于生长素调控水稻和微生物根鞘的形成 。这一发现揭示了中度土壤干燥条件下，水稻根鞘形成过程中 P. indica 与本地微生物群的合作贡献，对提高农业用水具有重要意义 。

论文ID

原 名： Coordination of root auxin with the fungus  Piriformospora   indica  and bacterium  Bacillus cereus  enhances rice rhizosheath formation under soil drying

译 名 ： 根系生长素与真菌印度梨形孢菌和细菌蜡样芽孢杆菌的配合促进土壤干燥下水稻根鞘的形成

期刊 ： The ISME Journal

IF： 10.302

发表时间： 2021.10.7

通讯作 者： 许卫锋

通讯作者单位： 福建农林大学生命科学学院

DOI： 10.1038/s41396-021-01133-3

实验设计

结果

1. 中度土壤干燥增加了水稻根鞘的形成

与WW相比，MSD增加了野生型NIP水稻根干重和根鞘形成量，而SSD降低了根干重和根鞘形成量（补充图S2A-C）。与WW相比，MSD处理下根鞘土胞外多糖（EPS）含量显著增加38%（补充图S2D）。 根系分泌物中糖和氨基酸含量在MSD处理下也显著高于WW处理 （补充图S2E）。与WW相比，MSD下乙烯相关基因的表达也显著增强（补充图S2F）。

 

2. 在中度土壤干燥条件下，内生真菌梨形孢菌（ P. indica ）进一步促进水稻根鞘的形成

为研究 P. indica 对水稻根鞘形成的影响，在WW和MSD条件下分别接种和不接种 P. indica 。结果表明，在根样品接种 P. indica 的PCR反应中可以扩增出 Pitef1 （补充图S1A）。此外，定殖后形成了带有绿色荧光的 P. indica 孢子（图1G，H）。接种 P. indica 后，NIP、ZH11和ZH3的总根长和根毛长分别比单独接种增加了9.6-21%和51-108%（补充图S1B, D）。与MSD单独接种相比，接种MSD后NIP、ZH11和ZH3的总根长和根毛长分别增加6-32%和53-92%（补充图S1C, E）。 MSD和MSD接种 P. indica （ MSD + P. indica ）均能形成根鞘，而WW和WW接种 P. indica （ WW + P. indica ）均不能形成根鞘 （图1A-D）。此外，与MSD单独处理相比，MSD接种 P. indica 后NIP、ZH11和ZH3根鞘土壤总干重增加了约38-86%（图1E）。在MSD接种 P. indica 下，NIP、ZH11和ZH3植株的根鞘土壤干重比单独接种MSD增加31-37%（图1F）。而且，田间条件下，接种 P. indica 的水稻分蘖数、总茎干质量、总根干质量和总根长均显著高于未接种 P. indica 的水稻（补充图S5A-D）。

 

图1. 中度土壤干燥（MSD）下接种 P. indica 根鞘比单独接种MSD更能促进水稻根鞘的形成。在水分充足（WW, A, B）和MSD（C, D）条件下培养未接种和 P. indica 接种水稻幼苗（NIP水稻）。水稻（NIP水稻）在MSD或MSD接种 P. indica （MSD + P. indica ）条件下均能形成根鞘，而在WW或WW接种 P. indica （WW + P. indica ）条件下则不能形成根鞘。研究了3个水稻品种（NIP、ZH11和ZH3）在WW、WW+ P. indica 、MSD和MSD+ P. indica 下根鞘土壤总干重（E）和特定根鞘土壤干重（F）。单株根鞘总土壤干重（mg）除以总根长（cm），即比根鞘干重。N.D表明根鞘未被检测到。数据为均值±SE (n = 8个重复)。不同处理间不同字母的条形在 p ＜0.05上有显著差异（ANOVA，Duncan s multiple range test）。G, H水稻幼苗（NIP水稻）根的荧光显微镜共聚焦显微镜显示皮层细胞内存在 P. indica 衣原体孢子（孢子呈绿色）。未接种GFP标记的 P. indica （ P. indica -GFP）水稻根系作为对照。

 

3. 在中度土壤干燥条件下，接种 P. indica 水稻根系生长素运输参与了水稻根鞘形成的增加

P. indica 通过产生生长素影响植物生长。本研究中 P. indica 菌丝的IAA浓度（生长素）约270 ng g ^{- 1} （图2A-Ⅰ）。接种 P. indica 后，水稻根系IAA浓度比未接种的提高约119%（图2A-Ⅱ）。为了更好地了解在WW和MSD下接种 P. indica 幼苗可能产生的生理差异，我们对WW和MSD条件下分别接种和不接种 P. indica 幼苗进行了转录组学比较。 MSD样品与WW样品比较，有1623个基因显著上调，1092个基因显著下调 （补充图S6A）。MSD与MSD接种 P. indica 相比，有3785个差异表达基因（补充图S6A）。KEGG富集分析表明，与只MSD处理相比，MSD + P. indica 处理植物激素信号转导途径（包括生长素信号转导途径）富集（补充图S6B）。前期研究表明， P. indica 可增加大白菜根部生长素信号的传递。因此，进一步分析了生长素相关差异表达基因 （图2B）。MSD接种 P. indica 后，生长素流出载体 OsPIN2 、 Os06g0660200基因表达增强。qRT-PCR结果表明，与MSD相比，接种 P. indica 、接种 B. cereus 以及同时接种 P. indica 和 B. cereus 时，水稻根系中生长素输出重要基因 OsPIN2 的表达量分别提高了2.2倍、2.3倍和3.9倍（补充图S6C）。

在MSD添加生长素流出抑制剂1-萘乙酸（NPA）的条件下，根鞘土壤总干重、比根鞘土壤干重和根毛长度均显著低于单独MSD处理（图2B, C，补充图S7A）。 与接种 P. indica 的MSD和NPA处理相比，接种籼稻MSD处理的总根鞘土壤干重、比根鞘土壤干重和根毛长度均有所降低 （图2B, C，补充图S7A）。

 

图2. 在中度土壤干燥条件下，接种 P. indica 根鞘对水稻根系生长素的响应具有重要意义。A，无 P. indica （−PI）和有 P. indica （+PI）的 P. indica 菌丝（I）或水稻根（II）的IAA浓度。数据为均值±SE (n = 8个重复)。在WW或MSD条件下，（+PI）接种和不接种籼稻（PI）之间的显著差异用学生t检验（*p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001）。B，WW、接种 P. indica 后的WW （WW + P. indica ）、MSD和接种 P. indica 后的MSD （MSD + P. indica ）下水稻根系中生长素相关基因的差异表达。C,D，生长素流出抑制剂NPA对水稻根鞘形成的影响。MSD条件下，测定了未接种（−PI）、NPA（+NPA）、接种籼稻（+PI）、籼稻和NPA处理（+PI +NPA）NIP水稻幼苗根鞘总土壤干重（C）和特定根鞘土壤干重（D）。数据为均值±SE (n = 8个重复)。不同处理间不同字母的条形在p＜0.05上有显著差异（ANOVA，Duncan s multiple range test）。E，在MSD条件下，无论是否接种 P. indica 根鞘，都需要生长素输出载体 OsPIN2 。研究了在MSD条件下，未接种（−PI）和接种籼稻（+PI）的水稻幼苗（WT、生长素外排载体OsPIN2突变体OsPIN2及其互补系）根鞘土壤干重。数据为均值±SE (n = 8个重复)。不同处理间不同字母的条形在p＜0.05上有显著差异（ANOVA，Duncan s multiple range test）。

 

4. 生长素输出载体 OsPIN2 是在中度土壤干燥条件下接种 P. indica 根鞘形成所必需的

为了进一步了解生长素外分泌是否参与了接种 P. indica 的MSD下根鞘的形成，利用生长素外分泌载体 OsPIN2 突变体 ospin2 、补充 OsPIN2 品系和WT水稻，研究了MSD下接种 P. indica 根鞘的形成。与MSD单独接种相比，接种 P. indica 和WT处理的根鞘土壤干重增加了21-25%，而 ospin2 只增加了~9%（图2E）。此外， 在WT中，与单独MSD处理相比，接种 P. indica 的MSD处理根毛长增加20-33% （补充图S7B）。而在 ospin2 中，MSD与接种 P. indica 的MSD的根毛长度无显著差异（补充图S7B）。

 

5. 在中度干燥的土壤条件下，接种 P. indica 根鞘和根内层芽孢杆菌数量增加

为了研究 P. indica 根鞘或根内层微生物群是否受其影响，采用16S rRNA基因扩增测序技术，分析了MSD和WW处理下根际、根鞘、根内层和土壤中细菌群落组成（补充图S8D）。稀疏曲线逐渐平缓并且Good’s覆盖率超过99.1%表明测序深度足以捕获微生物群落（补充图S8E；补充表S5）。主坐标分析（PCoA）表明， 在MSD和WW条件下，接种 P. indica 对根内层细菌群落组成（基于加权- unifrac距离）有显著影响，但对根鞘微生物组无显著影响 （图3C, D）。维恩图表明，在WW和MSD条件下，接种 P. indica 对根内层细菌OTUs数量有影响（补充图S8A-C）。MSD条件下，接种 P. indica 根鞘微生物群落α -多样性（Chao和Shannon指数）显著高于未接种 P. indica 根鞘微生物群落，根鞘微生物群落α -多样性无显著差异（补充图S8F, G）。此外， 在MSD和WW条件下， P. indica 对根内层细菌组成的影响也不同 （图3A, B）。MSD处理下，根内层厚壁菌门相对丰度从8.3%显著增加至41.6%，而变形菌门相对丰度从90.8%显著降低至51.3%（图3A）。这些门的分类变化主要是由于 Bacillaceae 、 Sporolactobacillaceae 和 Ruminococcaceae 的丰度增加或 Burkholderiaceae 、线粒体（ Mitochondria ）、 Enterobacteriaceae 和 Xanthomonadaceae 的丰度降低（图3B）。在WW处理下，接种 P. indica 根内层线粒体数量显著增加（13.5%-58.1%），伯克氏菌科（ Burkholderiaceae ）数量显著减少（64.2%-19.4%）（图3B）。这些结果表明， 在MSD和WW条件下， P.   indica 在根内层细菌群落的组装中发挥了重要作用。

与不接种MSD相比，接种 P.  indica 根茎鞘（从2.7%增加到4.1%）和根内层（从2.9%增加到14%）的厚壁菌门杆菌科丰度显著增加（图3B）。利用线性判别分析（linear discriminant analysis, LDA）效应量工具（LEfSe）分析发现，MSD处理下根茎鞘和根内层均富集了 Bacillaceae 科（图3E, F，补充图S8H）。 在MSD处理下，接种 P.   indica 在根鞘和根内层中芽孢杆菌属（属于杆菌科）的丰度分别比未接种处理高1.5倍和20倍 （图4A-C）。而在WW条件下，接种 P.  indica 根际和未接种 P. i ndica 根际芽孢杆菌的根际和根内层芽孢杆菌相对丰度无显著差异（补充图S9A, B）。通过菌落计数， P.  indica 显著提高了根内层和根鞘中芽孢杆菌属的丰度（补充图S10A）。综上所述， 在MSD处理下，接种 P.   indica 根鞘和根内层芽孢杆菌的数量显著增加。

 

图3.  Bacillaceae 科中含有许多促进植物生长的根际细菌，可能与接种 P. indica 的中度土壤干燥（MSD）条件下水稻根鞘的形成有关。A, B，在充分浇水（WW）和MSD条件下，接种 P. indica 和非接种水稻（PI）的不同根系单元（根内层和根鞘或根际）样品中，所有序列的门水平和科水平相对丰度均为＞1%。C,D，主坐标分析（PCoA，基于加权- unifrac距离）显示了未接种或接种 P. indica 在WW （C）或MSD（D）下根鞘（MSD）/根际（WW）和根内层（MSD）土壤、根鞘（MSD）/根际（WW）中细菌微生物群落组成的变化。利用线性判别分析（LDA）对土壤细菌类群（科水平）进行了分类，结果表明在普通土壤、未接种根鞘（PI）和接种 P. indica 根鞘（+PI）之间的丰度差异显著（E；LDA评分为3.2）在块状土、未接种的根内层（−PI）和接种籼草的根内层（+PI）（F；LDA评分3.5）在土壤轻度干旱情况。显著性检验p＜0.05。WBS，WW下的散装土；WRP，不接种WW对NIP水稻根际土壤的影响；WRP-PI，接种籼稻WW条件下NIP水稻根内层的研究；WRE，不接种WW条件下NIP水稻根内层的研究；WRE-PI，在WW条件下接种籼稻，NIP水稻的根内层；DBS，MSD下的散装土；DRH，无接种MSD条件下NIP水稻根鞘土壤的研究；DRH-PI，MSD接种籼稻对NIP水稻根鞘土壤的影响；DRE，无接种MSD条件下NIP水稻根内层的研究；DRE-PI，MSD接种籼稻下NIP水稻的根内层。

 

图4. 原生蜡样芽孢杆菌在根鞘或根内层的相对丰度是由根鞘或根内层的P. indica促进的，该蜡样芽孢杆菌能产生高浓度的生长素。在中度土壤干燥条件下，根鞘（A）和根内层（B）的细菌操作分类单元（OTUs）分别为未接种（-PI）、接种（+PI）和散装土。每个带颜色的圆圈代表不同的OTUs（相对丰度> 1%），红色箭头表示芽孢杆菌。每个圆的大小代表了它的相对丰度。每个圆的位置由每个处理的otu对总相对丰度的贡献决定。C，条形图显示了在MSD下，未接种（−PI）、接种 P. indica （+PI）和散装土壤根鞘和根内层中被分类为芽孢杆菌（OTU1256）的reads的相对丰度。数据为平均值±SE。不同处理之间有显著性差异（p < 0.05）。D，蜡样芽孢杆菌产生的IAA浓度。 -BC，培养基中不含蜡样芽孢杆菌；+BC，蜡样芽孢杆菌培养基。数据为平均值±SE。星号（***）在没有和有蜡样芽孢杆菌时，p < 0.001（Student’s t检验）显示有显著差异。

 

6. 中度土壤干燥条件下， P. indica 和 B. cereu s对水稻根鞘形成有显著促进作用

为了进一步探索哪些芽孢杆菌与 P. indica 合作，采用半选择性培养基，随机分离出239株芽孢杆菌候选菌株。在接触试验中， B. cereus 的相对菌落直径在候选菌株中最高（补充图S10B；补充表S6）。其次，在挥发性有机物相互作用分析中， P. indica 显著提高 B. cereus 的相对直径（补充图S10C）。 在灭菌土壤中，与未接种相比，接种 P. indica 显著增加了 B. cereus 的丰度 （补充图S10D）。结果表明， P. indica 增加了 B. cereus 的丰度。

与单独接种 P. indica 或单独接种 B. cereus 相比，接种 P. indica 和接种 B. cereus 的水稻根系IAA浓度最高（补充图S11A）。为了评价 P. indica 和 B. cereus 对根鞘形成的促进作用，WT、 ospin2 和补种系水稻在MSD处理下采用未灭菌或灭菌土壤，分别接种 P. indica 、 B. cereus 、 P. indica 与 B. cereus 组合或不接种（补充图S4B）。与未接种处理相比，在MSD处理下，接种 P. indica 、 B. cereus 和 P. indica 与 B. cereus 共接种均显著增加了WT和补种系的根鞘形成，而 ospin2 的根鞘形成无显著差异（图5）。此外， P. indica 和 B. cereus 联合处理的WT和补种水稻根鞘含量显著高于 P. indica 和 B. cereus 单独处理。然而， 相同处理的 ospin2 突变体的根鞘形成没有显著差异 （图5）。此外，在添加的碱性土壤（辽宁省蓉花山镇，122°86 E，39°93 N）中，接种 P. indica 和 B. cereus 也显著促进了MSD下水稻根鞘的形成（补充图S11B）。

 

图5. 利用生长素输出载体 OsPIN2 基因，在非灭菌或灭菌土壤中接种P. indica和蜡样芽孢杆菌，可促进水稻根鞘的形成。水稻幼苗的具体根鞘土壤干重（WT，生长素流出载体 OsPIN2 突变 ospin2 和互补1)与未接种（对照）；接种P. indica（+PI），接种蜡样芽胞杆菌（+BC），或 P. indica 和蜡样芽胞杆菌共接种到未灭菌土壤（+PI+BC）（A）或灭菌土壤（B）中。

讨论

1. 在中度土壤干燥条件下， P. indica 能促进水稻根鞘的形成

与旱作作物不同，水稻在MSD下可以形成根鞘，而在WW下不能形成根鞘。MSD处理下根鞘的形成显著高于重度土壤干燥（SSD）处理，表明MSD处理对水稻根鞘的形成更有利（补充图S2C）。因此，本研究探讨了 P. indica 对水稻根鞘形成的影响，并确定了MSD下水稻根鞘形成的调控因素。此外， 根系分泌物的数量和质量也受到干旱的影响。根系分泌物中的碳可以为土壤微生物提供能量 。在本研究中，与WW相比， MSD处理下根系分泌物中与根鞘形成相关的糖和氨基酸含量增加 （补充图S2E）。细菌产生的胞外多糖（EPS）显著提高了每个根组织的根粘着土壤。在干旱条件下，向日葵接种一株产EPS的菌株显著提高了粘根土壤的每根质量比。其中，MSD处理根鞘EPS含量显著高于WW处理（补充图S2D）。结果表明， 中度的土壤干燥可以通过调节根系分泌物质量和土壤EPS的提取来促进根鞘的形成 。

先前的研究表明， 丛枝菌根真菌的菌丝参与根鞘的形成。 在MSD处理下，能产生生长素并参与根系发育的 P. indica 显著促进了两种不同土壤类型（酸性和碱性土壤）水稻根鞘的形成（图1F，补充图S11B）。这可能是由于 P. indica 在MSD条件下通过生长素的调节促进水稻根毛的生长以寻找水分，这也为水稻根鞘的形成提供了重要的物理框架。

 

2. 在中度土壤干燥条件下，生长素在 P. indica 根鞘形成中起重要作用

根构型的改变与根中生长素的代谢或信号转导有关。接种 P. indica 后，水稻根系IAA浓度增加（图2A，补充图S11A），这与大白菜和大麦的结果一致。此外，与 P. indica 和 B. cereus 共接种的水稻根系IAA浓度最高（补充图S11A），说明接种后水稻植株、真菌和细菌都可以产生生长素。生长素在根系生长中起着重要的吸水作用。 与单独接种MSD相比，水稻根中生长素输出载体基因 OsPIN2 的相对表达量显著增加 （图2B，补充图S6C），说明生长素对根鞘的形成具有重要作用。此外，在MSD下，乙烯相关基因也显著增加（补充图S2F），这与我们之前的研究一致。本研究以MSD处理下 P. indica 根鞘的形成和生长素为研究对象。 在干旱条件下，植物通过调节根系生长素来吸收水分，往往会调整根系构型 。与WW相比，MSD处理下部分生长素相关基因的相对表达量也显著增加（图2B）。

当生长素运输受到NPA（一种生长素流出抑制剂）的抑制时，根鞘土壤总干重和根鞘土壤比干重显著降低（图2C, D）。这种减少的可能原因是在NPA处理下根毛长度较低（补充图S7B），这与我们之前的研究结果相似。大量研究表明， PIN2 主要不对称地定位于根分生组织和伸长区表皮上方，从而抑制根毛生长。当水稻植株（WT和互补水稻）接种 P. indica 时，根鞘的形成显著增加，但由于生长素没有被感知，因此在 ospin2 中没有显著增加（图5）。说明 在MSD条件下，生长素对 P. indica 根鞘的形成起重要作用。

 

3. 在中度土壤干燥条件下，真菌 P. indica 可与当地土壤细菌蜡样芽孢杆菌协同作用形成水稻根鞘

细菌-真菌相互作用是土壤环境中常见的相互作用，是重要生态系统功能和服务的重要驱动因素。这些相互作用允许各自的伙伴利用稀疏的碳质营养，这对任何一方或双方都是有益的。此外， 细菌群落对植物根鞘的形成也有积极的影响 。在MSD接种 P. indica 处理下，根鞘和根内层中芽孢杆菌的相对丰度显著高于单独MSD处理（图4A-C）。这可能是因为真菌分泌物是干旱胁迫下菌球中细菌的营养来源。在灭菌土壤和培养皿条件下， B. cereus 向 P. indica 方向生长，且在 P. indica 存在的条件下生长得更快（补充图S10C, D），说明 P. indica 可能与 B. cereus 互作。 此外，在未灭菌土壤条件下，接种 P. indica 的WT和 OsPIN2 水稻的根鞘形成显著高于灭菌土壤条件下（图5B）。与 P. indica 和 B. cereus 联合接种的WT和 OsPIN2 在MSD下根鞘形成最大（图5）。结果表明，菌株P. indica与当地土壤细菌蜡样芽孢杆菌共同作用于MSD条件下水稻根鞘的形成。

综上所述，该研究证明了 在MSD下， P. indica  （真菌）和蜡样芽胞杆菌（细菌）的合作通过生长素输出载体 OsPIN2 的参与促进了水稻根鞘的形成 （补充图S12）。这些结果提高了我们对 植物根系如何将微生物作用整合到干旱响应中的理解 ，有助于确定新的研究途径，以改善植物对变化的气候的适应。

原文链接： https://www.nature.com/articles/s41396-021-01133-3

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