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被忽略的强极性碱性化合物液相分析方法开发技巧!

时间：2023-06-20 来源： 浏览：

被忽略的强极性碱性化合物液相分析方法开发技巧!

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摘要
作为药物分析人员，碱性化合物是我们无法避免会遇到的一类化合物。对于弱极性碱性化合物（解离状态下，该类化合物对应的logD通常会大于0），其在酸性、中性及碱性流动相体系中，均可在常规C18色谱柱上获得良好的保留；对于中等极性化合物（在解离状态下，该类化合物对应的logD通常会在-1与0之间），其在小于自身pka的流动性体系中，在常规C18色谱柱上通常呈现极弱保留或无保留特性，在极性官能团嵌合的C18色谱柱（常见的有RP系列色谱柱、AQ系列色谱柱及T3色谱柱）上通常会得到有效保留；对于强极性碱性化合物（在解离状态下，该类化合物对应的logD通常会小于-1），其在小与自身pka的流动性体系中，在常规C18色谱柱及极性官能团嵌合的C18色谱柱上通常很难实现保留。
对于强极性碱性化合物无保留现象，常规增加保留的做法有：
1）配制高于化合物pka约1.5个单位的流动相，以维持化合物分子态，继而让化合物在耐碱C18色谱柱上产生保留；
2）选择强阳离子交换柱（键合磺酸基团），通过调节流动相的pH以维持磺酸基团及碱性化合物的离子态，通过库伦作用力增加化合物保留。其保留机理如下：
3）选择HILIC色谱柱通过强氢键作用力增加强碱性化合物的保留。
4）选择常规C18色谱柱搭配长链磺酸盐离子对试剂使用，以增加强碱性化合物的保留。其作用机理如下：

5）选择具有强阳离子交换作用、疏水作用及氢键作用的混合作用力色谱柱（如comix系列），以增加强碱性化合物的保留。

除此之外是否还有其他的选择呢？我们首先来看几个案例。

案例1：阿替洛尔（Atenolol）

该化合物的关键理化信息如下：

图1：阿替洛尔关键理化信息
由上，当流动相的pH≤5.5时，阿替洛尔的logD的预测值≤-2.82，常规流动相体系中很难实现有效保留。为实现该化合物的有效保留，EP收录的测定法采用了在流动相中加入长链烷烃磺酸盐的办法，具体色谱条件如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（RP18-5 end-Capped or Waters Symmetry C18, 150mm*3.9mm*5μm）；以磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾3.4g，辛烷磺酸钠1.0g，四丁基硫酸氢铵0.4g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值至3.0）-四氢呋喃-甲醇（900 : 20 : 180）为流动相，等度洗脱。流速为每分钟0.6ml；检测波长为226nm；进样体积为10μl。
对应的典型加样供试品谱图如图2所示：

图2：长链烷烃磺酸盐体系下阿替洛尔加样供试品谱图
Hisham Hashem 【1】 等为实现该化合物的有效保留采用了在流动相中加入高氯酸钠的办法，具体色谱条件如下：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Intersil® ODS-3, 150mm*4.6mm*5μm）；以50mM高氯酸钠溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱。流速为每分钟1.0ml；柱温箱温度为30ºC；检测波长为230nm；进样体积为20μl。

线性洗脱梯度程序

时间（分钟）

流动相A（%）

流动相B（%）

0

95

5

8

50

50

23

50

50

典型对照谱图如图3所示：

图3：高氯酸盐体系下阿替洛尔对照谱图
高氯酸盐体系下，阿替洛尔保留时间约为6min，对应的保留因子k≈2，此时的洗脱陡度为5.6%B/min，对应的有机相强度为34%，故此，缓梯度洗脱时，可以显著增加阿替洛尔的保留。由此，高氯酸可以代替长链烷烃磺酸盐用于流动相，来增加强极性碱性化合物的保留。
案例2：拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置异构（Imp G）

EP收录的测定法色谱条件如下：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Hypersil BDS C18, 150mm*4.6mm*5μm）；以磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使溶解，取磷酸缓冲液900ml、三乙胺6ml，混匀，用磷酸调节pH值至2.0）为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱。流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm；进样体积为10μl。

线性洗脱梯度程序

时间（分钟）

流动相A（%）

流动相B（%）

0

85

15

4

85

15

14

20

80
拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置异构（Imp G）分离图如图4所示：

图4：EP收录拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置异构（Imp G）分离图
Jelena Čolović 【2】 等人在如下色谱条件下研究了拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置异构（Imp G）分离情况：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Zorbax Extend C18, 150mm*4.6mm*5μm）；以140Mm高氯酸水溶液（用氢氧化钠水溶液调节pH值至2.5）-乙腈（77 : 33）为流动相，等度洗脱。流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm；进样体积为5μl。拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置异构（Imp G）分离图如图5所示：

图5：文献[2]拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置异构（Imp G）分离图
通过查询沃特世的Selectivity Chart，可知Hypersil BDS C18的疏水指数为2.455、选择性指数为0.291；Zorbax Extend C18的疏水指数为2.957、选择性指数为0.331，故此可默认两款色谱柱等效。高氯酸体系下拉莫三嗪（Lamotrigine）及其位置异构（Imp G）的分离优势可归因与高氯酸根。
根据上述两个典型的案例及相关文献 【3】 可以明确高氯酸钠作为离液剂的一种，可以实现强极性碱性化合物在酸性条件下的有效保留；可以提供结构类似的强碱性化合物优越的选择性；且可以规避长链烷烃类磺酸盐对色谱柱不可逆的改性。类似的作用的阴离子还有PF6-、ClO4-、BF4 -、CF3COO –等 【3】 。至于其作用机理不在此处展开叙述，感兴趣的同仁可自行研读相关文献。

参考文献

[1] Hisham Hashem, Ibrahim Adel Ehab. A novel stability indicating HPLC-method for simultaneous determination of atenolol and nifedipine in presence of atenolol pharmacopeoial impurities. J. Pharm. Sci., 2015, 5 (08): 017-025.

[2] Jelena Colovic, Milena Rmandic. Robust Optimization of Chaotropic Chromatography Assay for Lamotrigine and its Two Impurities in Tablets. Chromatographia, 2018.

[3] J. Flieger. The effect of chaotropic mobile phase additives on the separation of selected alkaloids in reversed-phase high-performance liquid chromatography Journal of Chromatography A, 1113 (2006) 37–44

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