【实用帖】解决峰拖尾与峰前延小妙招
【实用帖】解决峰拖尾与峰前延小妙招
PREP_2019
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引起 峰形异常的因素很多，柱外死体积引起峰形异常有个特点： 对先出的峰影响大，对后出峰影响小； 柱头塌陷、柱头和筛板污染会引起所有的峰形都异常，而硅醇基次级保留只引起部分峰拖尾。 相塌陷除了引起保留下降外，也会造成峰拖尾。
反相色谱中，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾，原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。
反相填料表面有残余的硅羟基，具有一定的酸性，其pKa约为4.5～4.7。根据电离规律，流动相的pH-pKa>2即pH>6.7时，99%以上的硅羟基应该是呈离子状态的，即Si-O- ，而pKa-pH>2即pH<2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99%以上的硅羟基应该是呈分子状态的，即Si-OH，但其极性仍然存在，即Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多。同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生强的静电作用而被推迟洗脱出来，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。
完全硅羟化的硅胶表面硅羟基浓度为8mol/m2，由于空间位阻的作用，通常与C18硅烷基发生反应的仅达2～3.5mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羟基反应，如图中的三甲基氯硅烷，使硅羟基中的氢变成了三甲基硅烷的一个惰性基团。三甲基硅烷还是比氢原子大得多，还是不能将所有的残余硅羟基的活性封闭掉。
相同的样品在不同品牌的柱子上产生拖尾的严重性不同，从填料合成的角度而言就是键合密度是否高、封尾是否彻底，高密键合和彻底的封尾能显著减少这种机会，获得良好的峰形。
由于样品过载引起的峰形后拖不能通过改变色谱条件消除。如果发现过载，需降低进样量(包括进样体积或浓度)，进样量越小，峰形越好， 例子如头孢尼西钠的测定：
2)调节流动相pH
将流动相的pH调至比弱酸pKa小2以上，比弱碱pKa大2以上，可有效抑制易离子化待测物的电离，从而取得良好峰形。 例子如二甲基苯氧乙酸的测定：
碱性化合物中，甲胺的pKa为10.64，那么在pH< 8.64的时候它是完全呈离子态的， 那么pH在2.5~8.64时，特别是pH6.7～8.64时，此时甲胺和硅羟基均以离子状态-NH3+和Si-O-形式存在的，它们之间相互吸引的静电作用导致后拖，这就是为什么很多碱性化合物在pH 7.0的条件下容易产生拖尾的原因。而很多色谱柱生产商也因此以阿米替林(含-N(CH3)2，碱性比-NH2强)在pH 7.0的条件下来评价和比较不同色谱柱之间的优劣，该条件下的阿米替林的峰形越好说明封尾越好。而在pH<2.5的条件下，也仍然后拖，是因为-NH3+足够强，即使硅羟基以分子状态存在也仍能够与Si-Oδ-Hδ+中氧原子产生吸引作用，导致峰形拖尾。当pH>12.64，大于pKa2以上时，甲胺完全以分子状态形式存在，不会引起拖尾。
3)增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度
流动相中加入缓冲盐，增强了流动相的离子强度，在-NH3+等极性基团和硅羟基Si-O-之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会，有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。 这种适合于碱性较弱(如氨基的N原子与强吸电子基相连)，或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基，例子如高乌甲素的测定：
4)加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等
拖尾的产生是因为-NH2、-NHR、-NR2与硅羟基发生静电作用引起的，那么阻碍它们之间静电作用的途径，应该有两种， 一种是占据硅羟基这个作用位点，另一种是占据-NH2、-NHR、-NR2这个作用位点。
在流动相中加入三乙胺，能显著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羟基。三乙胺的pKa为11.09，在pH<11.09-2=9.09的条件下是以离子状态N+H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64 硅羟基呈Si-O-离子态的情况下，N+H(CH2CH3)3容易与Si-O-形成相对较强的静电吸引力。
加入三乙胺改善峰形的时候，有两点需要注意：
1)三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤。 pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，可能引起的其它问题，建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值。通常即使pH回调过后，由于三乙胺成为了固定相的一部分，保留时间也有较大变化;
2)三乙胺在210nm处有比较强的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。
四烷基季铵盐(如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等)在水中电离后，也形成了类似N+H(CH2CH3)3的结构N+(CH2CH2CH2CH3)4 ，这种结构也能有效的与Si-O-产生较强的静电作用，阻止氨基与硅羟基的接触，改善峰形。而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是，它在低波长范围的吸收比三乙胺弱。
峰前延发生的概率比较小，下面是三种前拖峰的表现形式：
造成前延峰的原因有多种，我们可依次逐一排查：
1)样品是否过载
降低进样浓度，看峰形是否有所改善。一般认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。
2) 检查是否是用流动相溶解样品
溶解样品的溶剂(如纯甲醇)洗脱能力比流动相强会发生峰前延。
具体机理是： 正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过 程中任何时候都呈正态分布。 样品 溶液进样后到达色谱柱时间很短，应还未被流动相充分稀释，洗脱能力更强的样品溶剂的局部存在，将使部分样品被洗脱的速度加快，导致峰前延。
3)增加流动相中缓冲盐的浓度
往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道和使用，但其机理似乎少人提及。通常所加入的量在5%以内即可，需要的时候可以加入更大的量。
4)升高柱温
升温有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖，但温度不宜太高，温度太高容易损伤色谱柱，特别是含有离子对试剂的时候，最好不要超过40度。
柱头污染和柱头塌陷都会造成裂峰，最常见的原因是筛板上颗粒物堵塞样品进入色谱柱不均一，只需反冲色谱柱将颗粒物除掉就可解决。
1. 保留时间的重现性
在色谱分析中最重要的是分离选择性，保留时间的重现性则是可简单通过用峰面积定量代替峰高定量来消除其对分析结果的影响。 温度、流动相组成、pH、离子强度等的微小变化都会引起保留时间的改变。 10-20柱体积流动相平衡是 必须的。 三乙胺等添加剂加入，平衡时间需加长。
固定相流失：
1) 在酸性条件下键合相碳链水解断裂流失;
2)碱性条件下硅胶基质溶解导致在基质上键合固定相流失;
3)pH2-8下，上述两种因素导致的流失仍会缓慢发生。 多位键合比单点键合好，长链比短链键合牢固，用于封尾的键合相易流失;C18链的稳定性比CN基链大三个数量级，一个是3个月会有明显流失，一个是1小时;用有机相洗柱子会加快流动相的流失。
柱污染： 污染物作为固定相的一部分起保留作用，随着污染程度的逐步增加，保留时间发生趋向性的变化。
流动相组成变化: 如甲醇等挥发引起保留时间逐步变大。
相塌陷： 纯水条件下，C18柱会发生固定相塌陷，引起保留时间逐步变小甚至失去保留能力。
2. 柱与柱之间的重现性
同一批填料生产出的不同柱子，装柱密度或柱体积的不同引起保留时间不一致。同样尺寸规格柱子，填料装得越结实，柱体积越小，保留时间越快。正常情况只有百分之几的差别。
平衡程度、老化程度、使用历史及污染程度的不一样都会导致两根同品牌同批次色谱柱之间的保留时间不一致。
3. 批与批之间的重现性
由于不同批次填料之间的差异性导致。主要是表面键合度(可用载碳量指标)和羟基活性方面的差异。可调整方法提高方法的适应性，或者让厂商备存足够的同批次的适应方法的填料。
色谱柱如果得到正确使用、维护和保养，寿命会很长。 在使用保护柱的情况下，有寿命超过1万针的实例。如果不用保护柱，即便得到很好保养维护，一般能用到2000针左右就不错了。不过保护柱频繁换柱芯的成本也不低，而且使用装填不好的保护柱还会影响分离质量。
对硅胶基质色谱柱，流动相p H值和样品清洁程度对寿命影响较大。 个人认为高柱温对寿命有影响，但不大，即使方法要求70摄氏的柱温，也没发现有显著的寿命缩短。进针前样品处理得越干净，色谱柱寿命当然越长。但样品前处理也是需要花钱的，需要在前处理成本、色谱柱成本和数据质量之间进行权衡。
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基于中美药典及ICH指导原则的药品质量标准建立与分析方法开发验证培训班
时间： 07月21日-23日
地点：成都市
课程概述
药物分析方法的建立和应用是药物研发和质量控制分析的核心内容。伴随着法规对产品及其生产工艺生命周期管理的要求，制药企业如何从分析方法生命周期的角度开发高效的分析方法并应用于质量控制分析，是摆在全球制药行业研发和质量管理层面前的重要问题。为 此， 我们定于 202 3 年 07 月 21 日 -23 日 在 成都市 举办 “ 基于中美药典及 ICH 指导原则的药品质量标准建立与分析方法开发验证培训班 ”，
课程时间安排
07月22日
9:00-12:00 13:30-16:30
基于中美药典与
ICH
指导原则的药品质量标准建立规范化过程解析
一、如何依据中美欧药典及
ICH
指导原则确定质量标准研究内容
1
制剂通则规定及制剂特性要求
2
质量研究与制备工艺研究、稳定性研究之间的关系
二、如何依据中美药典与
ICH
指导原则建立分析方法
1
根据选定的研究项目及试验目的确认被选择分析方法所要达到的目标
2
原料药及制剂生产分析方法选择及质量控制
3QbD
分析方法设计与产品质量控制
4
原料药和制剂特性品质的建立
三、如何依据中美药典与
ICH
指导原则确定质量标准的项目及限度
1
残留溶剂限度控制及限度制定依据
2
杂质和降解产物的控制及限度设置
3
举例说明：①原料药的进厂检验标准的制定；②进口药品注册标准的起草；③放行标准与货架期标准的比较等
四、如何撰写符合中国药典格式的质量标准
1.
不同研发阶段的质量标准制订关注点
2.
依据中国药典的规范用语及格式制订出合理、可行的质量标准
3.2020
版药典中关于色谱法新体例格式解读等
4.
实例说明质量标准叙述中应注意的问题
主讲人：张老师 北京市药品审评专家，北京药监局新药研制现场核查专家， CFDA 高级研修学院客座讲师。在北京市药品检验所任职近 30 年，主要负责药典标准的起草和复核、国内新药的审批以及进口药品的质量标准复核工作。
7月23日
9:00-12:00 13:30-16:30
基于
ICH
指导原则
的分析方法
开发
验证
一、
ICHQ14分析方法开发要求细读与启示
1）
引言
-Q14背景、关键原则、指南目的、期望的获益
；
2）分析方法目标配置文件(ATP)研究；
3）分析方法开发和持续改进的知识和风险管理 ；
4）分析方法耐用性和参数范围的评价 ；
5）分析方法控制策略-分析方法既定条件；
6）分析方法生命周期管理和批准后的变更；
7）开发多变量分析方法
8）开发实时放行检测分析方法-特殊考虑
9）分析方法相关信息的提交
10）实例分析
例
1 小分子药物中作为特定工艺有关杂质的异构体测量
例
2 抗肿瘤坏死因子 α 单克隆抗体的效价测量
二
、基于
USP与ICH的分析方法验证
1)
方法验证基本要求
1 分析方法验证适用范围 2.分析方法的生命周期管理
3 可报告范围确定 4 稳定性指示方法 5 多变量分析方法
2)
分析方法验证的主要内容及关键要点
1专属性评估，多种方法验证方法的专属性
2准确度实验设计原则和可接受标准
3精密度实验设计原则和可接受标准
4 工作范围确定
4.1 校准模型建立 线性或非线性和范围设计的基本原则
4.2 低范围限的验证，检测限和定量限的评估
5方法耐用性的设计和评价
6 系统适用性试验的选择
主讲人：王老师 原省药检验院副院长、主任药师
会务费
培训费： 2600 元 / 人，包含 ( 专家费、资料费、场地费、现场问答等 ) 。食宿统一安排，费用自理。（团队报名可享优惠）
培训报名联系人 ： 王老师
微信/手机：15506140531（微信同号）
会议培训汇总
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