科研 | 南农（IF：7.086）：粪肥引入的外源细菌对土壤细菌群落组成和网络形成的潜在作用（国人佳作）

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编译：微科盟道友留步，编辑：微科盟小编、江舜尧。

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导读

 通过向土壤中引入大量养分和外源微生物，粪肥有助于作物生产和可持续农业。然而，外源微生物对施肥后土壤细菌群落和网络结构的影响仍存在争议。在这项研究中， 使用高通量测序对未灭菌（R+C）或灭菌（R+SC）粪肥以及未施肥对照（R）的细菌群落和网络结构进行了表征。 结果表明，培养90天后，粪肥OTU的相对丰度从10.4%下降到4.6%，并且对照组和施肥组（R+C和R+SC）之间的Bray-Curtis距离随着培养时间的延长而逐渐增加。可以认为，粪肥施肥通过干扰本地细菌的生长而不是粪肥细菌的定植来改变土壤细菌群落。网络分析表明，由粪肥的OTU的一个子集，即Xanthomonadale （目）， Promicromonospora （属）和 Constrictibacter （属）充当模块之间的连接体。他们不仅增强了土壤OTU和粪肥OTU之间的相互作用，而且还增强了本地细菌内部的相互作用，这一结果支持了 粪肥细菌的引入在很大程度上促进了土壤细菌网络关联性。 此外，粪肥OTU与土壤pH呈正相关，而大多数土壤OTU与各种物理化学变量（pH、DOC、NO ₃ ）呈负相关（pH, DOC, NO ₃ ⁻ 和 LAP）。我们的研究强调了粪肥细菌在调节施肥后土壤微生物群落和网络形成中的关键作用。

图文摘要

论文ID

原 名： The potential role of fertilizer-derived exogenous bacteria on soil bacterial community assemblage and network formation

译 名 ： 粪肥引入的外源细菌对土壤细菌群落组成和网络形成的潜在作用

期刊 ： Chemosphere

IF： 7.086

发表时间： 2021.09

通讯作 者： 李辉信

通讯作者单位： 南京农业大学资源与环境科学学院；江苏省固体有机废物资源化利用协同创新中心

DOI： 10.1016/j.chemosphere.2021.132338

实验设计

结果

1 土壤的理化性质

Kruskal-Wallis检验表明（ P <0.0001），施肥显著提高了土壤pH值和NO ₃ ^- -N含量。在为期90天的培养过程中，R+C和R+SC的pH值保持在6.24和6.17以上，大于对照组R（5.19-5.06）。与对照组R相比，施肥处理后NO ₃ ^- -N的浓度急剧增加。 施肥也显著增加了土壤DOC（ P =0.0094）和SR（ P =0.0001） 。而施肥后BG、CB、XYL等酶活性均无显著差异。相比之下，Kruskal-Wallis检验表明（ P <0.01），施肥后AG、LAP和NAG活性显著增强。

2 土壤细菌群落的多样性和组成

经过质量过滤，共获得1,984,648条高质量16SrRNA基因序列，以97%的相似度聚类成5509个OTU，用于群落分析。初始施肥后OTU数量为676 ± 20.1，显著低于对照组（R）（2093±98.6）（图S1）。未灭菌粪肥（R+C）显著增加了土壤中的OTU数量（Kruskal-Wallis检验， P <0.05），并且在对照组（R）和施有灭菌粪肥的土壤（R+SC）之间没有观察到显著差异（图2A）。然而，基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）表明，无论施肥的粪肥是否灭菌，都会显著改变土壤细菌群落组成（PERMANOVA， P <0.001）（图2B）。此外， 对照组和施肥组（R+C和R+SC）之间的Bray-Curtis距离随着培养时间的增加而逐渐增加（图2C），表明它们之间的差异随着培养时间的增加而增加 。

在至少一个样品中相对丰度高于 0.1% 的77个丰度属中，我们进一步鉴定了3个处理中丰度显著不同的47个属（图S2）。与对照组相比， 施肥增加了一些属的相对丰度 ，包括 Flavisolibacter, Flavitalea, Glycomyces  和  Micromonospora ， 并降低了一些属的相对丰度 ，如隶属于Acidobacteria的 Acidibacter, Acidobacterium  和 Acidothermus 。

图2 对照组（R）、未灭菌粪肥施肥（R+C）和灭菌粪肥施肥（R+SC）土壤中细菌α多样性（A）和群落结构（B）的变化。 （A）在培养期间 （90 天） ，施肥后 OTU的数量变化。点颜色加深表示培养天数的增加。小写字母表示基于存在显著差异，基于LSD事后检验的Kruskal-Wallis检验（ P < 0.05）；（B）基于Bray-Curtis 距离的主坐标分析 （PCoA） 展示了施肥后细菌群落组成的差异；（C）同一采样时间对照组（R）与施肥组（R + C, R + SC）之间的动态 Bray-Curtis 距离。

 

3 粪肥OTU的时间变化

通过edgeR（调整后 P <0.05）鉴定出了1792个在对照组和施肥组之间具有显著差异的OTUs。在这些OTUs中，1294个在对照组中富集的OTUs被定义为土壤的OTUs，498个在施肥土壤中富集的OTUs定义为粪肥的OTUs（图3A）。与对照组相比，Anaerolineae，Cytophagia，Flavobacteriia，Gammaproteobacteria和Sphingobacteria的相对丰度显著高于施肥土壤。与此同时，纲水平下的Acidobacteria，Betaproteobacteria，Gemmatimonadetes，Ktedonobacteria和Solibacteres的相对丰度显著高于对照组（图S3）。 对照组和施肥土壤中由土壤的OTUs的相对丰度分别为94.4%和0.5%。 同时，施肥土壤和对照组土壤中粪肥的OTUs的相对丰度分别为98.2%和1.2%（图3B），这证实了土壤和粪肥的OTUs分类的合理性。

粪肥的OTUs在施入土壤后迅速减少（图3C）。粪肥的OTUs的相对丰度在30天内从10.4%急剧下降到5.3%，然后在实验结束时逐渐下降到4.6%。我们进一步证实了 53个粪肥的OTUs （划分为6个门）在90天的培养中显著降低，在实验结束时，它们的相对丰度从6.399%下降到0.838% （图3D，表S1）。其中相对丰度较高的OTU被归类为属 Myceligenerans、Glycomyces、Paracoccus 和科Anaerolineaceae、OM。在90天的培养过程中，只有3种粪肥的OTU显著增加，包括 Hydrogenispora、Steroidobacter 和 Mesorhizobium 。在实验结束时，它们的相对丰度从0.197%增加到0.855%（表S2）。

图3 未灭菌粪肥施肥后粪肥的OTUs丰度随时间变化。 （A）火山图展示了使用edgeR在对照组和施肥组之间识别的差异OTUs（调整后 P <0.05）。红点代表粪肥的OTU，绿点代表土壤的OTUs，蓝点代表其他OTUs。（B）对照组和施肥组中由土壤和粪肥的OTUs相对丰度。（C）未灭菌粪肥施肥后土壤的OTUs和粪肥的OTUs的相对丰度动态变化。（D）未灭菌粪肥施肥（R+C）处理下（ P ≤0.05），53种粪肥的OTUs的相对丰度在培养期间（90天）显著降低。

4 共现网络和关键类群

施肥后显著相关性（正和负）和节点的比例均增加（图S3，表1），尤其是在使用未灭菌粪肥（R+C）的组中。此外，施肥后共现网络的平均路径距离和直径高于对照（表1）。我们进一步分析了土壤的OTUs和粪肥的OTUs在共现网络中的不同作用及其在粪肥施肥后的反应（图4A-C）。结果表明， 未灭菌粪肥处理（R+C）后，65个粪肥的OTUs占据了网络节点 （表S3）。代表粪肥OTU的节点的引入不仅增加了粪肥OTUs的内部相关性，而且增加了R+C处理下土壤OTUs和粪肥OTU之间的相互关联（表S4）。

根据Zi值和Pi值，我们分别在对照组、未灭菌和灭菌粪肥处理的三个网络中确定了8、29和17个关键OTUs（图4D-F）。对于对照组（R），共现网络中只有1个模块中心和7个连接器，其关键类群丰度为1.22%（表S5）。它们大多属于Gaiellales 目；Nitrosomonadaceae 科； Anaeromyxobacter 和  Ramlibacter 属。未灭菌的粪肥施肥（R+C）增加了关键 OTU的数量，其中26个关键 OTUs被确定为连接器，3个关键 OTUs被确定为模块中心（表S5）。在26个连接器中，R+C处理中有18个土壤的OTU和6个粪肥的OTUs（表S6）。粪肥的关键OTU被确定为Xanthomonadales目。 Promicromonospora ，  Constrictibacter 属也被确定为R+C中连接度最高的OTU。另外两个关键分类群被确定为 Flavitalea 属和Acidimicrobiales目（表S7）。值得注意的是， 它们均没有在对照组（R）中被检测出。R+C中29个关键OTUs的总丰度高达2.90%，高于对照。 灭菌粪肥的应用还增加了关键OTUs的数量，其中12个关键OTUs被确定为连接器，5个关键OTU被确定为模块中心。前5个关键类群为 Nitrosospira、Candidatus Solibacter、Catenulispora、Paenibacillus 属和Rhodospirillaceae科（表S8），R+SC处理下关键类群总丰度达到2.46%。

表1 三个共现网络的拓扑特性。

图4 共现网络显示，与对照（R）相比，施肥（未灭菌粪肥（R+C）和灭菌粪肥（R+SC））后土壤细菌内的相互作用增加，特别是在添加未灭菌粪肥的组中（R+C）。 仅保留ρ>0.6的显著相关性（ P <0.001）以构建共现网络。连接代表两个节点之间的显著正spearman秩相关（ P <0.001）。节点的颜色代表各个OTUs的不同来源，红色节点代表土壤来源，绿色节点代表粪肥来源，灰色节点代表其他。节点的大小表示与邻居节点的联系程度。详细的网络特性列于表1和表S3。与对照（R）相比，施肥（未灭菌粪肥（R+C）和灭菌粪肥（R+SC））关键OTUs的数量增加，尤其是添加未灭菌粪肥（R+C）的组。Zi-Pi图根据Zi（模块内连通性）和Pi（模块间连通性）揭示细菌节点的分布。节点的颜色代表来自不同来源的单个OTU，红色节点代表土壤来源，绿色节点代表粪肥来源，蓝色节点代表其他。节点的大小代表每组下OTU的相对丰度。用于对OTUs进行分类的Zi和Pi的阈值分别为2.5和0.62。

5 网络结构与土壤理化性质的关系

Mantel检验表明土壤pH、DOC、NO ₃ ⁻ -N和LAP是土壤和粪肥的细菌组成和网络结构中最有影响的土壤理化特性（图S4）。我们进一步研究了关键类群与土壤理化变量（pH、DOC、NO ₃ ⁻ 和LAP）之间的相关性（图5）。 所有粪肥的OTU均显示与pH值正相关，而大多数土壤的OTU确定与各种物理化学变量（pH、DOC、NO ₃ ⁻ 和LAP）呈负相关。 R+C处理下29个关键类群的时间丰度表明，大多数关键类群在90天的培养期间保持一定的丰度（图5）。土壤的细菌分类为 Granulicella ， Gemmatimon a ，   Granulicella ，   Pseudarthrobacter 属，粪肥的细菌分类为Acidimicrobiales目、Anaerolineaceae科和 Promicromonospora 属。

图5 左侧热图展示了90天培养期间，在R+C处理下29个关键分类群的log ₁₀ 转化丰度。 右侧热图显示了29个关键类群（土壤的OTUs、粪肥的OTUs等）与土壤理化变量（pH、DOC、NO ₃ ⁻ 和LAP）之间的相关性。*   P  <0.05； ** <0.01，** <0.001。

讨论

1 施肥改变土壤细菌群落的主要原因是有机成分的输入

    粪肥富含有机成分和外源微生物，施用于土壤时可以直接或间接改变微生物的栖息地环境条件。作为应对，土壤微生物群落在受到干扰后，可能对这种扰动表现出抗性作用（即不敏感）、弹性作用（即恢复到原始组成）或表现得十分敏感（即转变到另一个不同但稳定的状态）。无论粪肥是否杀菌，施肥几天后细菌组成都将发生显著变化，并在整个培养期内保持这种状态，这一结果表明施肥对土壤细菌群落有明显的长期影响。前人的研究强调了 粪肥中的化学和有机成分对土壤细菌群落组成具有重要影响。 我们的研究表明，红壤中的细菌群落主要受粪肥化学和有机成分的影响，理化性质的结果进一步支持了这一点。R+C和R+SC处理都显示出类似的pH、NO ₃ ^- -N和DOC升高的结果（图1）。此外，PCoA分析表明（图2B），在灭菌（R+SC）和未灭菌（R+C）处理之间没有观察到显著影响。三种处理之间显著差异的丰富属也揭示了它们的相似性。R+C和R+SC均表明，施肥后，隶属于Acidobacteria的 Acidibacter, Acidobacterium  和  Acidothermus 菌的相对丰度显著降低，这与之前的观察结果不同。这一结果在意料之中，因为在本研究中，在低pH值下，许多属于Acidobacteria的细菌更加丰富，并且在施肥后土壤pH值显著升高。 R+C和R+SC之间的相似性表明引入的外源微生物对土壤细菌群落的影响有限。 先前的研究强调了那些从粪肥引入土壤的外源微生物可能会影响土壤微生物群落。考虑到在灭菌粪肥处理（R+SC）中检测到粪肥的OTUs的存在，这可能是因为OTU2、OTU76、OTU618等微生物死亡后DNA在土壤中保留了一段时间（表S1）。另一个原因 可能是一些细菌在灭菌后存活了下来，因为在潜伏期内，OTU76、OTU2、OTU127等几种OTUs的丰度有所增加，分为Acidimicrobiales目、Anaerolineaceae科和Rhodothermaceae科。 在这项研究中，在50 kGray剂量的γ辐射灭菌后，超过70%的细菌在土壤中不存在DNA的情况下成功灭菌。虽然我们未能生产出严格灭菌粪肥，因为原核生物可以在接受100 kGray剂量长期γ辐射后仍然存活。

图1 对照组（R）、未灭菌粪肥（R+C）和灭菌粪肥（R+SC）的理化性质的变化（90天）。 DOC，溶解有机碳；NH ₄ ⁺ ，氨氮；NO ₃ ^- ，硝态氮；SR，土壤呼吸；AG，葡萄糖苷酶；BG，β-葡萄糖苷酶；CB，纤维二糖水解酶；木糖苷酶；LAP，亮氨酸氨肽酶；NAG，乙酰氨基葡萄糖苷酶。

2 粪肥通过干扰本地细菌的生长而不是粪肥细菌的定植来改变土壤细菌群落

微生物组成的变化可能是由本地细菌利用粪肥中的有效养分生长或粪肥中的细菌定植引起的。粪肥细菌的丰度随着潜伏期的延长而减少（表S1），例如 Myceligenerans、Glycomyces、Paracoccus、Promicromonospora 和 Anaerolineaceae 。这些优势属在堆肥过程中被鉴定为粪腐生菌，据报道能够加速堆肥过程中有机物的降解。这些属的相对丰度在培养90天后下降， 可能是由于厌氧环境的变化和土壤中易于利用的碳源有限，导致它们与本地细菌相比竞争能力较低。 在90天的培养过程中，只有3种粪肥的OTU显著增加，包括 Hydrogenispora、Steroidobacter 和 Mesorhizobium 。据报道， Steroidobacter 能够使用硝酸盐作为电子受体同时降解雌二醇和睾酮，而 Mesorhizobium 被证明与NO ₃ ^- -N呈正相关。这些属的富集可能是由于土壤中NO ₃ ^- -N的不断增加。随着粪肥的OTU丰度的结果下降，预计原生土壤微生物组会恢复。然而，土壤细菌Bray-Curtis距离在粪肥处理过程中不断增加，与我们的观点相一致，即施肥在培养期间对土壤土源微生物具有持久且不可逆的影响。与土壤中的本地微生物相比，粪肥引入的细菌的影响可以忽略不计，这可能是由于它们的竞争条件较低。此外，本实验未检出 Salmonella, Clostridium, Campylobacter, Escherichia coli 等潜在致病菌，以及典型的条件致病菌 Mycobacterium, Staphylococcus 和 Streptococcus 。可以推测，粪肥的细菌在引入后可能不会影响潜在病原菌的流行，这与Semenov等人（2021）的研究结果一致。

3 粪肥的 OTU 占据了关键类群并增强了本地细菌内的相互作用

先前的研究表明， 有机物输入可以增强土壤细菌共现网络的复杂性，而外源微生物在加强共现网络模式方面的作用有限。 我们的研究支持了引入的外源细菌也有助于复杂细菌网络的形成这一观点。外源细菌增强的细菌间相互作用不仅发生在土壤的OTU和粪肥的OTU之间，而且发生在本地细菌内部。尽管粪肥细菌的丰度随着养分消耗而减少，但预计本土细菌内部联系更紧密的网络将提供更多的功能冗余，并在更长的时间内提高养分的有效利用。

关键类群被认为是高度连接的类群，无论其丰富程度如何，都对网络结构和功能产生重大影响，包括作为网络集线器、模块中心和连接器。在这项研究中，在R+C处理下增加的粪肥网络连接器、模块中心，也就是 Promicromonospora 及 Constrictibacter ，曾经被认为是长期有机耕作后农业生态系统中的丰富属。据报道，它们可以分解土壤中的纤维素、纤维二糖、木聚糖或木质纤维素材料。在这项研究中，它们与土壤pH值呈正相关。除土壤pH值外，Xanthomonadales还与土壤养分含量DOC呈正相关。Yan等人（2019）证实， Xanthomonadales与碳循环有关，因为它们具有降解碳氢化合物的能力，这有望在促进网络中不同细菌物种之间的营养和代谢物交换方面发挥关键作用。 然而，仍然需要做很多工作来揭示粪肥的关键类群与生态功能之间的联系。

结论

该研究表明，粪肥细菌的丰度随着培养时间的延长而减少。 粪肥改变了土壤细菌群落组成，原因主要是由于有机成分的输入。 尽管引入的外源细菌的丰度随着培养时间的推移而减少，但粪肥的OTU占据了网络关键类群，并增加了内部土著微生物的相互作用。预计本地细菌内的相互作用将提供更多的功能冗余并在更长的时间内提高对营养物质的有效利用。

原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0045653521028101

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