STOTEN高被引 | 安徽农业大学王毅：一种用于检测环境和生物体中Hg2+的可逆近红外荧光探针

由于Hg ²⁺ 的 生物累积性 和 永久性损害 ，它对人类健康和环境构成了巨大威胁。因此，构建了一种可识别Hg ²⁺ 的可逆近红外荧光探针2-(3-(E)-4-((E)-4-(二乙胺-2-羟基苄基)氨基)苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈(DHEY)。 DHEY具有较大的Stokes位移(157 nm)、良好的选择性、高灵敏度(LOD=3.2 μg/L)和快速响应效率(<3 min)等优点 。有趣的是，DHEY 循环7次后 也能实现Hg ²⁺ 的快速有效检测。成功回收不同环境水样中的痕量Hg ²⁺ ，充分显示了DHEY在实际应用中的潜力。特别是，DHEY可以实时观察外源性Hg ²⁺ 在HeLa细胞和斑马鱼中的分布和转运模式。这项研究为利用荧光技术研究重金属离子在环境中的归宿提供了重要的理论支持。

将对氨基苯甲醛、（3，5，5-三甲基亚环己-2-烯亚基）丙二腈和200 μL哌啶混合于30 mL 乙醇中，并使混合溶液回流反应4h，获得ADYM。将4-（二乙基氨基）水杨醛和ADYM溶于乙醇（30 mL）中，并在回流下反应12小时。将反应物冷却至室温后，通过过滤漏斗收集固体沉淀，并在乙醇中重结晶，得到纯DHEY（图1）。

图1 DHEY的合成路径

Fig.1 Synthesis pathway for DHEY

DHEY具有较大的 Stokes位移（157 nm） （图2a），能够降低荧光自猝灭效应和瑞利散射所引起的背景干扰。图2b-c确定了DHEY的最适溶剂是DMSO,以及最适pH是7.4。此外，DHEY还具有 较强的稳定性 （图2d），通过计算得知，DHEY-Hg ²⁺ 体系的准一级反应速率常数为0.0138 s ^-1 ，表明了DHEY对Hg ²⁺ 具有 较高的检测灵敏度 （图2d）。

图2 DHEY的光谱图(a)荧光光谱图和紫外-可见光谱图，(b)不同溶剂下的光谱图，(c)不同pH下的光谱图，(d)含Hg ²⁺ 和不含Hg ²⁺ 的DHEY荧光强度随时间变化图。

Fig.2 Spectrogram of DHEY (a) Fluorescence spectrograms and UV-Vis spectrograms, (b) Spectrograms at different solvents, (c) Spect- rograms at different pH, (d) Fluorescence intensity of DHEY with and without Hg ²⁺ versus time.

当Hg ²⁺ 和其他分析物加入DHEY溶液时，只有Hg ²⁺ 的加入才使DHEY的荧光强度发生显著变化（图3a），这说明了 DHEY对Hg ²⁺ 具有特异性检测 。此外，加入Hg ²⁺ 后，肉眼可以观察到探针的颜色有橙色变成粉红色（图3a）。图3b显示了在只将其他分析物加入到DHEY的溶液中和再向其加入Hg ²⁺ 的荧光光谱图，前者的荧光几乎没有，然而后者具有较强的荧光强度且强度几乎一样，这说明 DHEY具有较强的抗干扰性 。

图3 DHEY含不含Hg ²⁺ 的光谱图(a) DHEY在不同干扰物存在下的荧光光谱图，(b) DHEY和Hg ²⁺ 在其他干扰物存在下的荧光强度。

Fig.3 Spectrogram of DHEY with and without Hg ²⁺ (a) Fluorescence spectra of DHEY in the presence of different interferents, (b) fluorescence intensity of DHEY and Hg ²⁺ in the presence of other interferents.

图4a显示了DHEY与Hg ²⁺ 的Job曲线，由此可以看出 DHEY与Hg ²⁺ 的化学计量比是1：1 。为研究DHEY与Hg ²⁺ 的反应机理，采用红外光谱(FT-IR)、核磁共振(NMR)、高分辨质谱和DFT计算对DHEY-Hg ²⁺ 体系进行了验证 (图4b-e)， 表明了DHEY与Hg ²⁺ 的相互作用模式是螯合增强荧光机制 。

图4 DHEY的机制探究图（a）Job曲线，（b）DHEY和DHEY-Hg ²⁺ 体系的红外光谱图，（c）DHEY和DHEY-Hg ²⁺ 体系的核磁共振氢谱图,（d）DHEY的高分辨质谱图, （e）DHEY和DHEY-Hg ²⁺ 体系的DFT计算图。

Fig.4 Mechanisms of DHEY exploratory map (a) Job’s curves, (b) FTIR spectra of DHEY and DHEY-Hg ²⁺ systems, (c) 1HNMR spectra of DHEY and DHEY-Hg ²⁺ systems, (d) High-resolution mass spectra of DHEY, (e) DFT calculations of DHEY and DHEY-Hg ²⁺ systems.

可逆性 也是评价荧光探针性能的重要标准，因为荧光探针的重复使用在绿色可持续性领域具有重要意义。汞是一种“亲硫元素”，很容易与硫反应，产物相当稳定。因此，用Na ₂ S作为猝灭剂来研究DHEY对Hg ²⁺ 的可逆性。DHEY-Hg ²⁺ 体系本身表现出强烈的红色荧光，DHEY-Hg ²⁺ 体系的荧光强度随着Na ₂ S的加入急剧下降，最终荧光消失(图5)。出现上述现象的原因是S ²⁻ 在DHEY-Hg ²⁺ 体系上与Hg ²⁺ 竞争形成HgS, HgS将DHEY从配合物中释放出来。当再次加入Hg ²⁺ 时，DHEY-Hg ²⁺ 体系的荧光可以恢复， 这个过程可以重复7次，这也证明了DHEY与Hg ²⁺ 结合过程的可逆性 。

图5 通过交替加入S ^2- 和Hg ²⁺ 来控制DHEY荧光的可逆性

Fig. 5 The reversibility of DHEY fluorescence controlled by alternating the addition of S ^2-  and Hg ²⁺

选择HeLa细胞作为生物模型，采用CCK-8法测定HeLa细胞在不同浓度DHEY溶液中24 h的存活率（图6a）。当DHEY的浓度为40 μM时，HeLa细胞的存活率超过80%（图6a），说明了 DHEY的细胞毒性较低，具有良好的细胞相容性 。图6b-c显示了有无DHEY和Hg ²⁺ 的细胞和生物成像，表明 DHEY可以选择性地量化和可视化外源性Hg ²⁺ 在HeLa细胞和斑马鱼中的分布和迁移 。

图6 Hg ²⁺ 在HeLa细胞和斑马鱼中的成像

(a)细胞毒性实验, (b)有无DHEY和Hg ²⁺ 的HeLa细胞荧光图像, (c)斑马鱼有无DHEY和Hg ²⁺ 的荧光图像

Fig.6 Imaging of Hg ²⁺ in HeLa cells and zebrafish

(a) Cytotoxicity assay, (b) Fluorescence images of HeLa cells with and without DHEY and Hg ²⁺ , (c)Fluore- scence images of zebrafish with and without DHEY and Hg ²⁺

设计开发了一种基于 螯合增强荧光机制 的近红外荧光探针DHEY，用于在复杂的环境中快速有效地检测Hg ²⁺ 。DHEY对Hg ²⁺ 具有 良好的响应性能，Stokes位移大(157 nm)，响应时间短(<3 min)，检出限低(16 nM) 。通过1HNMR、HRMS和DFT计算验证了DHEY与Hg ²⁺ 的相互作用机理。DHEY对不同环境水样中Hg ²⁺ 的回收实验，有力地证明了DHEY在复杂环境水样中的实际应用潜力。令人兴奋的是 ， DHEY能够实时监测Hg ²⁺ 在HeLa细胞和斑马鱼体内的分布和迁移 。 DHEY的合成策略可为开发对杂原子有亲和力的重金属离子荧光探针提供理论参考。