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科研 | 浙大：发酵玉米和大豆副产物混合底物的综合微生物组和代谢动力学(国人佳作)

时间：2022-05-16 来源： 浏览：

科研 | 浙大：发酵玉米和大豆副产物混合底物的综合微生物组和代谢动力学(国人佳作)

微科盟小木 微生态
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编译：微科盟小木 ，编辑：微科盟小编、江舜尧。

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导读

发酵食品中产生的微生物及其代谢物被认为是影响最终产品质量的关键因素，但对植物性食品固态发酵过程中的微生物和代谢动力学的全面认知仍不清楚。本研究将益生菌枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis )和粪肠球菌( Enterococcus faecalis )接种到玉米和脱脂大豆中，实现两步固态发酵。采用16S测序和液相色谱串联质谱技术研究发酵过程中微生物群、代谢物的动态变化及其相互关系。结果表明，优势菌在0 h时由 Streptophyta 和立克次氏体目(Rickettsiales)转变为有氧阶段的芽孢杆菌( Bacillus ) 和假单胞菌 ( Pseudomonas )，厌氧阶段主要是芽孢杆菌、肠球菌( Enterococcus )和假单胞菌。在不同的发酵时间共鉴定出229种显著差异代谢物，其中 蛋白质降解、氨基酸合成和碳水化合物代谢是发酵过程中的主要代谢通路。 值得注意的是， 苯丙氨酸代谢是发酵过程中最重要的代谢通路 。进一步分析微生物群、代谢物和理化特性之间的相关性，发现芽孢杆菌( Bacillus  spp. )在有氧阶段与氨基酸和碳水化合物代谢显著相关，肠球菌( Enterococcus  spp. )在厌氧阶段与氨基酸代谢和乳酸生成显著相关。本研究揭示了不同发酵阶段代谢和微生物特征的代谢动态变化，有助于今后植物性发酵食品的质量研究。

论文ID

原 名： Integrated Microbiomic and Metabolomic Dynamics of Fermented Corn and Soybean By-Product Mixed Substrate
译 名 ： 发酵玉米和大豆副产物混合底物的综合微生物组和代谢动力学
期刊 ： Frontiers in Nutrition
IF： 6.576
发表时间： 2022.2
通讯作 者： 汪以真
通讯作者单位： 浙江大学
DOI号： 10.3389/fnut.2022.831243

实验设计

 

结果

1 理化参数与微生物群落的变化
补充表S1中列出了营养成分。pH值从有氧发酵阶段到厌氧发酵阶段急剧下降，而乳酸含量在48 h时增加了约3倍。粗蛋白质(CP)含量从28.21%增加到31.54%，小肽(SP)含量急剧增加。值得注意的是，在整个发酵过程中，直链淀粉、NDF、植酸磷、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白水平均呈显著下降趋势。
玉米和脱脂大豆发酵过程中细菌群落组成如图1所示。α-多样性用来衡量一个样本或一个生态系统内的多样性。最常用的两个α多样性指数是丰富度(数量)和均匀度(分布)。Rank曲线显示，枯草芽孢杆菌( B. subtilis )处理后最初24 h内α-多样性降低，而在厌氧发酵阶段增加(图1A)。β-多样性代表基于微生物群落组成的明确比较(中间)，并提供了每个样本对之间的距离或差异的度量。结果表明，基于NMDS和Jaccard距离的微生物β-多样性在不同时间点存在明显差异，微生物群落结构被划分为4个集群(图1B)。结果表明，优势菌在0 h时由 Streptophyta 和立克次氏体目(Rickettsiales)转变为有氧阶段的芽孢杆菌( Bacillus )和假单胞菌( Pseudomonas )，在厌氧阶段又转变为芽孢杆菌( Bacillus )、肠球菌( Enterococcus )和假单胞菌( Pseudomonas )(图1C)。线性判别分析效应大小(LEfSe)分析显示(图1D)，不同发酵时间点的菌群从目到属水平存在显著差异。24 h时，芽孢杆菌( Bacillus )、葡萄球菌( Staphylococcus )和气球菌( Aerococcus )的丰度显著增加，48 h时肠球菌、假单胞菌、片球菌( Pediococcus )和 Facklamia 为优势属。
图1 发酵过程中微生物群落的变化。(A)发酵过程中OTUs rank曲线。(B)利用基于Jaccard距离的非度量多维尺度(NMDS)排序和物种水平的相似性分析(ANOSIM)进行β-多样性分析。(C)发酵过程中属水平细菌群落组成。(D)基于LEfSe分析的重要属的 Cladogram 图(LDA>3.0)。
 
2 不同发酵时间点代谢物的聚类分析
无监督主成分分析( PCA )可以揭示组间和组内的变化，反映组间和组内的分布趋势和可能的离散点。第一主成分(PC1= 67.0%)和第二主成分(PC2= 16.5%)直接显示了组间的异同(补充图S1A)。结果表明：0、12、24、48 h的发酵样品均被第一主成分分离，所有样品均在95%置信椭圆范围内。因为PCA是一种无监督模型，属于探索性分析，所以不能根据PCA图产生的视觉差异来完全解释样本之间的准确差异。因此，采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的监督分类模型来确定代谢物随发酵时间的变化程度。结果显示，不同发酵组之间有明显的分离，表明可以用来鉴别底物发酵过程中的代谢差异(补充图S1B,C)。进一步的聚类分析是为了确定在发酵过程中代谢产物是否存在差异。从图中可以看出，所有的样本被聚类成四组，每一组样本都属于同一时间点(补充图S1D)。结果表明，该方法具有良好的稳定性和重现性，且 发酵过程中代谢物的变化具有时间依赖性 。
 
3 不同水平代谢组分的变化
代谢组分析显示，核苷、核苷酸和类似物，脂质和类脂分子，碳水化合物，氨基酸、多肽和蛋白质是整个发酵阶段主要丰富的代谢物(图2A)。发酵过程中氨基酸、多肽和蛋白质的相对丰度不断增加( P <0.05)，而核苷、核苷酸和类似物以及脂质和类脂分子的相对丰度持续下降( P <0.05)。碳水化合物在0~12 h下降，然后保持相对稳定的状态。为了找到相关代谢物的具体变化，我们探索了前20种代谢物的下一级代谢通路(图2B)。0 h时主要的代谢物为黄豆苷、lysoPC(16:0)、甘油磷酸胆碱、lysoPC[18:2(9Z,12Z)]和5-氨基戊酸。12 h时前5种代谢产物分别为黄豆苷、正缬氨酸、lysoPC[18:2(9Z,12Z)]、2’-O-甲基腺苷和5-氨基戊酸。正缬氨酸、3,3,5-三碘-L-甲状腺素-β-D-葡萄糖醛酸苷、5-氨基戊酸、咪唑-4-乙醛、lysoPC[18:2(9Z,12Z)]和2’-O-甲基腺苷为24 h时的优势物质。值得注意的是， 代谢产物的浓度在厌氧阶段急剧升高 。苯乙醛在厌氧阶段显著升高，成为主要的代谢物。3,3,5-三碘-L-甲状腺素-β-D-葡萄糖醛酸苷和正缬氨酸在48 h时均高于24 h。 在整个发酵过程中，黄豆苷持续减少， 5- 氨基戊酸持续增加。  

图2 发酵过程中不同水平代谢组分的变化。 (A)主要代谢物的相对组成。 (B)不同发酵时间的前20种代谢物。
 
3 发酵过程中的差异代谢物
为了更好地了解主要不同代谢物的变化，我们根据变量投影重要性(VIP)对主要代谢物进行了筛选和排序。注释后共鉴定出229种代谢物，这些代谢物在发酵后的不同时间点具有个体代谢特征。选取发酵过程中差异显著的前35种代谢物(图3A)，根据PLS-DA模型得到这35种代谢物的VIP值(图3B)。0 h时富集的显著差异代谢物主要有氧化三甲胺、1,3,5-三羟基苯、胞苷环2’,3’-磷酸、异阿魏酸3-硫酸盐、N’-羟基新蛤毒素、曲二糖、环AMP和芹菜素7-O’’-(6’’-O-乙酰葡萄糖苷)。这8种代谢产物在0~12h略有降低，而在24 h和48 h显著降低( P ＜0.05)。烟曲霉文、硬脂酸盐(deterrolstearate)和Fumitremorgin B是24 h的代谢生物标志物。48 h时共24种代谢物显著上调，其中nnal-N-氧化物、4-(亚硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮和9,10-环氧十八烷酸的VIP得分最高。其中苯丙氨酰-天冬酰胺、(E)-4-[5-(4-羟基苯氧基)-3-戊烯-1-炔基]苯酚、9,10-环氧十八烷酸、锡兰肉桂素[10]-脱氢姜二酮、(x)-2-庚醇葡萄糖苷和布卢门醇C葡萄糖苷在48 h时含量最高。
图3 发酵过程中显著差异代谢物。 (A)前35种显著差异代谢物。 (B)采用变量投影重要性(VIP)对前35种差异代谢物进行散点图分析。
 
4 通过识别显著差异代谢物预测代谢通路
利用KEGG数据库探讨发酵过程中的代谢通路，阐明代谢变化的机制。通过富集分析和拓扑分析来寻找与代谢物最相关的关键通路。在整个发酵过程中，共整理出22条代谢通路，涉及229种不同的代谢物(补充表S2,S3)。为了更直观直观地比较不同发酵时间点代谢通路的差异，我们保留了前20条代谢途径(图4)。在整个发酵过程中，苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、生物素代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢是主要的代谢通路。淀粉、蔗糖代谢和嘌呤代谢在0 h时富集，直到发酵结束时才开始下降。24 h时牛磺酸和亚牛磺酸代谢、甘油脂代谢和甘油磷脂代谢均显著上调。48 h时，苯丙氨酸代谢、生物素代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、精氨酸生物合成和谷胱甘肽代谢等15种代谢通路均显著增加。这些结果揭示了发酵过程中不同代谢通路的变化，特别是发酵条件的改变引起的相关代谢的改变。

图4 通过识别显著差异代谢物来预测代谢通路。 显著差异代谢物基于VIP>1和 P <0.05筛选。
 
5 发酵过程中不同微生物群、 营养价值、代谢物和代谢通路的相关性
为了进一步研究观察到的细菌、营养指标、代谢物和代谢通路变化的影响，我们进行了相关性分析。在24 h富集的芽孢杆菌、葡萄球菌( Staphylococcus )和 Aerococcus 与营养价值和代谢物的关系与0 h富集的微生物相反。芽孢杆菌、葡萄球菌和 Aerococcus 与氨基酸、含氮化合物呈正相关，与脂类、核苷呈负相关，对底物的营养价值有贡献(图5A)。值得注意的是，芽孢杆菌与碳水化合物呈负相关。厌氧阶段代谢物、微生物群和养分之间的相关性如图5B所示。肠球菌和 Facklamia 与粗蛋白、小肽、乳酸呈显著正相关，与大部分代谢物呈显著负相关。进一步研究微生物与代谢通路之间的相关性，发现 有氧阶段芽孢杆菌与淀粉和蔗糖代谢呈负相关，与大部分氨基酸代谢呈正相关 (图5C)； 厌氧阶段肠球菌与氨基酸代谢呈正相关 (图5D)。
图5 微生物群、代谢物、养分和KEGG通路之间的关系。 有氧阶段(A)和厌氧阶段(B)微生物群、代谢物和养分之间的关系。 微生物群和代谢物之间的关系预测了有氧阶段(C)和厌氧阶段(D)的KEGG通路。 *** P < 0.001，**0.001< P < 0.01，*0.01< P < 0.05。
 
6 发酵过程中功能通路的综合微生物组和代谢组变化
综合代谢通路显示在代谢组可视化图中(图6)。基于KEGG数据库，共鉴定出6条一级微生物代谢通路，包括碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、其他氨基酸代谢、聚糖生物合成与代谢。从有氧到厌氧阶段，碳水化合物代谢持续增加，而辅因子和维生素代谢、聚糖合成与代谢从0 h到48 h下降。脂质代谢和其他氨基酸代谢在12 h富集，氨基酸代谢在24 h增加到较高水平。在二级代谢通路中，淀粉和蔗糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢表现出相反的表达变化趋势。初级胆汁酸生物合成和甘油脂代谢在0~48h持续增加，但甘油磷脂代谢下降。C-赖氨酸是碳水化合物代谢、脂质代谢和氨基酸代谢三大代谢通路的产物，可在卟啉和叶绿素代谢中转化为5-氨基乙酰丙酸。甘油磷脂代谢产生磷脂酰乙醇胺，进一步生成磷酸乙醇胺，12h时含量较高。L-半胱氨酸和牛磺胆酸盐的含量下调，L-半胱氨酸是牛磺酸的前体，可转化为牛磺胆酸盐。

图6 功能通路的综合微生物组和代谢组变化。 KEGG二级代谢通路是根据显著差异代谢数据选择的。 KEGG二级和三级代谢通路的丰度由16S数据预测。

讨论

近年来，植物性发酵食品因其潜在的健康益处而受到关注。以玉米和大豆发酵为基础的食品(如发酵玉米粉、纳豆、腐乳、味噌、豆豉和酱油)很受欢迎，因为它们是人类重要的植物性食品，在全球有巨大的消费量。许多研究报道称发酵能够减少抗营养因子，使原底物更加美味和营养。然而，利用微生物组和代谢组研究玉米和大豆发酵副产物的动态却很少。本研究采用多组学方法研究了发酵玉米和脱脂大豆在微生物发酵过程中的时间变化。发酵玉米和脱脂大豆的成熟过程主要涉及芽孢杆菌、肠球菌和假单胞菌。重要的是， 苯丙氨酸代谢是厌氧发酵阶段主要的重要代谢途径。 相关性分析表明芽孢杆菌在有氧阶段与氨基酸有较强的相关性，而肠球菌在发酵厌氧阶段主要产生酸和氨基酸。
采用两步发酵法，发现发酵过程中代谢物的变化具有时间依赖性。PLS-DA分析和代谢物结构表明，各组间代谢谱存在显著差异。微生物分析还表明，两段固态发酵过程中微生物群落发生了动态变化。这些结果表明， 发酵过程中代谢物的变化可能是由不同阶段微生物生态位的变化引起的 。最近的一项研究报道发现，不同的发酵豆制品有不同的可溶性和挥发性代谢物。此外，发酵微生物和代谢物有助于腐乳的口感和风味。这些发现对于将代谢物视为评估植物性发酵食品的一种方式具有重要意义，且代谢物可用于了解发酵阶段。
代谢物的注释进一步表明，发酵过程中碳水化合物、氨基酸和脂类代谢活动占主导地位，这与以往关于发酵豆瓣酱的研究一致。在本研究中，发酵过程中氨基酸、多肽和蛋白质增加，而脂质和类脂分子以及碳水化合物减少。这些结果与厌氧发酵阶段随着抗原蛋白、NDF、ADF、直链淀粉和粗脂肪含量的降低以及粗蛋白水平的升高而发生的营养变化是一致的。对于单个代谢物，大豆中的天然有机化合物黄豆苷是乙醇代谢产生的乙醛氧化的基本元素，可被常驻细菌转化为次级代谢产物。大豆和以大豆为材料的产品中含有丰富的黄豆苷，它在人体肠道中很难被吸收。 发酵过程中黄豆苷含量的下降表明，发酵提高了异黄酮的生物利用度并有助于蛋白质的消化。 5-氨基戊酸是一种赖氨酸降解产物，可由细菌分解赖氨酸产生。非靶向尿液代谢组学分析表明，5-氨基戊酸是一种生物标志物，对高脂饲料诱导的大鼠高脂血症具有保护和治疗作用。5-氨基戊酸含量的增加表明发酵提高了底物的潜在效益。值得注意的是，在48小时内观察到苯乙醛的急剧增加。苯乙醛是中国传统酱油和无酒精啤酒中典型的芳香化合物。这些结果表明，这些风味化合物对发酵玉米和脱脂大豆的价值有重要贡献。
显著差异代谢物的鉴定进一步证实了发酵引起的各种代谢物的显著变化。已有研究报道，几种细菌(芽孢杆菌和假单胞菌)在食品发酵过程中代谢降解氧化三甲胺(TMAO)。临床证据表明，TMAO水平升高与动脉粥样硬化和血栓形成等疾病风险增加有很强的相关性。本研究表明，发酵阶段TMAO水平持续下降，芽孢杆菌和假单胞菌富集。这些发现与之前的报道一致，表明发酵可以减少有害物质。二肽和游离氨基酸的来源主要是由微生物分泌的蛋白酶分解发酵大豆的蛋白质成分引起的。Jin等人发现发酵玉米、脱脂大豆和麸皮中富含L-茶氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸，并与益生菌组合孵育。研究表明，在以大豆为底物的发酵过程中，大多数氨基化合物的浓度逐渐升高。苯丙氨酰-天冬酰胺、蛋白质丝氨酸和异亮氨酰-组氨酸的浓度随着时间的推移显示出稳定的增加，这支持了先前研究的观点。苯丙烯酰天冬酰胺和异亮氨酸组氨酸是蛋白质消化或分解代谢的不完全分解产物。苯丙氨酸、异亮氨酸和组氨酸是必需氨基酸。丝氨酸是一种促进健康的化合物，在许多涉及脂肪、脂肪酸、细胞膜代谢和健康免疫系统的蛋白质中具有重要功能。这些代谢物的结果直接暗示了发酵过程中蛋白质的降解和氨基酸、肽及类似物的产生，可能在发酵玉米和脱脂大豆的品质改善中发挥重要作用。
为了揭示发酵过程中显著差异代谢物的特定作用，使用KEGG数据库对影响最大的通路进行了表征。大豆发酵过程中苯丙氨酸和谷氨酰胺的含量增加。酪氨酸被认为是人类和动物不可缺少的膳食氨基酸，膳食中补充苯丙氨酸是一种常见的补偿方式。谷胱甘肽是一种主要的抗氧化剂，其代谢方式多种多样，导致谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和其他氨基酸的生物合成。本研究表明， 苯丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸代谢和甲硫氨酸代谢是发酵过程中最重要的 3 个代谢通路。 我们之前的研究也表明，按照预测的微生物功能，氨基酸代谢的含量随着发酵的进行而逐渐增加。这些结果表明，玉米和脱脂大豆发酵过程中氨基酸代谢活跃，氨基酸数量增加。此外，苯丙氨酸代谢是花青素生物合成的主要途径。花青素作为一种具有抗氧化、抗菌、抗病毒和抗血栓作用的有效代谢物，引起了人们的广泛关注。发酵后还能检测到花青素，说明发酵可以提高发酵物质的营养价值。因此，这些受影响的代谢途径与发酵玉米和脱脂大豆密切相关，为进一步研究两步发酵对其代谢物的影响提供了线索。
复杂的微生物-生态相互作用影响代谢物的产生。在第一阶段有氧发酵中，芽孢杆菌迅速增殖。相关研究报道，芽孢杆菌是西非种子调味品发酵中主要的发酵菌，负责富含蛋白质的食品的自然发酵、风味物质的产生、将复杂的食物化合物转化为小成分。在尼日利亚大豆发酵调味品中，芽孢杆菌是整个发酵过程中的优势菌种。芽孢杆菌与氨基酸和含氮化合物呈正相关，表明芽孢杆菌的蛋白质水解导致蛋白质中肽、氨基酸和氨的增加。此外，芽孢杆菌分泌的淀粉酶、半乳糖酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶和呋喃果糖苷酶对复合碳水化合物的降解也说明芽孢杆菌与碳水化合物在有氧阶段存在正相关关系。肠球菌是一种产乳酸菌和耐酸菌，在食品生产中发挥着重要作用，特别是它们可以通过蛋白质水解、脂肪分解、碳水化合物分解和芳香族化合物的产生来加速食品的成熟，改善口感和风味。在厌氧发酵阶段，肠球菌属是绝对优势属。肠球菌和芽孢杆菌分泌的酶在蛋白质水解过程中发挥了重要作用，并且在整个过程中发生了氨基酸和相关物质的积累，导致肠球菌和氨基酸之间存在正相关关系。食物中的小肽一般都是容易被肠道吸收和利用的，其中大多数具有特定的生物功能，如改善肠道健康和免疫功能。微生物与代谢通路的关系进一步证实了芽孢杆菌分解蛋白质和碳水化合物以及肠球菌合成氨基酸的作用。详细了解发酵微生物群及其独特的功能特性是开发高质量、安全的发酵产品和增强特别适应的发酵剂培养物的基础。这些结果表明 芽孢杆菌和肠球菌是玉米和脱脂大豆发酵的关键菌，可能是两步发酵的最佳选择菌株。
对代谢途径图谱的概述将有助于进一步解释这些代谢物差异的原因，并探索代谢机制。有趣的是，氨基酸代谢丰度在有氧阶段增加，但在48 h时突然下降，根据预测的微生物功能观察到碳水化合物的持续增加。这些发现与代谢组学分析不同，表明仅基于微生物数据的发酵过程动力学分析存在局限性和偏差。在第一阶段，直接参与氨基酸代谢的芽孢杆菌等细菌导致代谢能力增加。随着碳水化合物降解菌的增殖和第二阶段酸化程度的增加，发酵的主要代谢逐渐转变为碳水化合物代谢。因此，进一步解释了不同发酵阶段的优势代谢功能。理化特征与代谢产物的变化相一致，验证了两步发酵过程中细菌的显著差异引起的代谢差异。植物性发酵食品的代谢过程十分复杂，我们在研究中发现的这些代谢物的具体代谢机制尚不完全清楚。因此，今后的研究应重点关注次级代谢物，并建立用于发酵的标准化代谢指纹图谱。

结论

本文系统研究了玉米和脱脂大豆发酵过程中营养特性、微生物组成和代谢物的动态变化。苯丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢被认为是影响发酵玉米和脱脂大豆品质的重要代谢通路。结果进一步揭示了 芽孢杆菌( Bacillus spp.)是有氧阶段主要参与蛋白质和碳水化合物分解的优势属，而肠球菌( Enterococcus spp.)则与发酵末期氨基酸代谢和乳酸产生有关 。本研究可为提高玉米和脱脂大豆食品的营养水平奠定基础，并指导植物性食品固态发酵的潜在发酵机制。
原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2022.831243/full

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