NC丨光交联引发不依赖STIM1的类CRAC通道的Orail激活

大家好!今天给大家分享一篇2023年2月发表在nature communications上的文章，题目是“Photocrosslinking-induced CRAC channellike Orai1 activation independent of STIM1”。

摘要

钙释放激活钙离子通道（ CRAC ），对免疫系统不可或缺，由两种跨膜蛋白组成，内质网膜上的 Ca ²⁺ 浓度感受器 STIM1 和细胞质膜上的钙离子通道 Orail ，文章利用基因密码子拓展技术向细胞 Orail 蛋白的不同位点引入光交联非天然氨基酸，通过钙成像以及电生理学等手段表征在激光照射条件下， CRAC 的影响。研究表明在 A137 插入非天然氨基酸 Bpa 并光照交联可达到正常激活状态下的钙离子电流并且可以在不需要 STIM1 蛋白的情况下，调控下游信号通路转录因子 - 活化 T 细胞核因子（ NFAT ）异位进入细胞核。

研究内容

1. 1.       在 TM2 、 TM3 和 TM4 中筛选能够紫外光照射激活 Orail 蛋白的 UAA 插入位点

本研究中的光交联非天然氨基酸选用 Azi 和 Bpa ，主要筛选范围为 Orail 蛋白的 TM 结构域，结果显示在分别插入 Azi 和 Bpa 的 20 个位点中，分别有有 7 个和 8 个位点紫外照射后较之前激活。其中 Orai1 A137Bpa (TM2), Orai1 L174Bpa (TM3) and Orai1 A254Azi(TM4) 突变体光照前后激活较为显著，作为重点研究。

研究表明 HEK 293 细胞从 0mM Ca ²⁺ 溶液转换到 2mM Ca ²⁺ 溶液时， Orai1 A137Bpa (TM2), Orai1 L174Bpa (TM3) and Orai1 A254Azi(TM4) 突变体，细胞内 Ca ²⁺ 水平小幅度上升，并且在第一次紫外照射条件下（ 10s ）大幅上升，而第二次紫外照射条件下（ 30s ）不再上升（下图 abc ）。另外在时程实验中这三个突变体也在紫外照射条件下展示出了瞬时的该电流信号激活（ def ）。另外三种 Orail 突变体与野生型 CRAC (Orai1 + STIM1) 有着相同的大约 +50mV 逆转电压（ ghj ）。

1. 2.       光激活引发的钙通道激活不依赖于 STIM1

接下来，作者研究了含有光交联 UAA 的 Orai1 突变体的是否受到 STIM1 的影响。在三种 Orai1 光交联 UAA 突变体、野生型 CRAC (Orai1 + STIM1) 以及各自的 STIM1 敲除组中进行实验，结果表明 Orai1 光交联 UAA 突变体组钙离子电信号在光照前后发生显著的钙内向整流，与另外两组相比有着相同的 +50mV 逆转电压。

荧光共振能量转移技术表明细胞从 2mM Ca ²⁺ 切换到 0mM Ca ²⁺ +1uMCa ²⁺ -ATP 酶抑制剂（ TG ）条件下， STIM1+Orail 突变体和野生型在紫外照射条件下和无紫外照射条件下有相当的能量转移水平，即 STIM1 可以调节含有光交联 UAA 的 Orai1 突变体的活性。

但是 STIM1 对于含有光交联 UAA 的 Orai1 突变体的 UV 照射激活不必要的。

3.光交联诱导的Orai1激活适用于触发Ca2+依赖的下游信号传导过程

作者研究了紫外线触发的含光交联UAA的Orai1突变体的激活是否适合触发HEK293细胞中的NFAT易位到细胞核。与未暴露于紫外线或过表达Orai1野生型的对照细胞相比，紫外线介导的对所有三个突变体（Orai1 A137Bpa/L174Bpa/A254Azi）的刺激以显著更高的水平触发NFAT易位到细胞核。值得注意的是，Orai1A137Bpa表现出最明显的紫外线触发的NFAT易位。类似地，我们在含有Orai1 A137Bpa或Orai1 A254Azi的RBL-2H3细胞中观察到紫外线触发的NFAT易位，与TG刺激的Orai1表达细胞相当，并且与未刺激的细胞显著不同。

光交联诱导的Orai1激活导致CRAC通道样Ca2+内流，适合触发活化T细胞的核因子（NFAT）。 光交联引发局部构象变化，作为整体结构变化转移到整个通道复合体并引发孔隙打开， 随后的Ca2+内流导致下游信号级联的激活，如NFAT的核转位。

总结 本质上，作者采用了一种强大的方法来转移对Orai1的光敏感性，以远程和严格控制Ca2+依赖性下游信号传导。实验结果证明，TM结构域在选定位置的光交联足以诱导开孔，而不是STIM1。光敏Orai1突变体库将有助于剖析决定生物物理性质的结构特征以及CRAC通道的未知结合界面，这将刺激结构和计算研究。在体内，这项新兴的技术有可能为天然离子通道的生物学提供基本的见解，并发现有利于人类治疗的新靶点。

DOI:  10.1038/s41467-023-36458-4

撰写人：王德祥