伊利诺伊大学赵惠民团队：工程改造圆红冬孢酵母高产三乙酸内酯

三乙酸内酯 （triacetic acid lactone，TAL）是一种简单但有趣的聚酮化合物。它已被证明是一种潜在的平台化学品，可用于生产具有商业价值的 双功能化学中间体和终产品，包括间苯三酚、乙酰丙酮和山梨酸 。

然而，它的工业应用受到有害催化剂和有毒副产物的阻碍，因此，非常需要开发一种环境友好的生物途径，将廉价的底物转化为TAL。有研究表明，非传统产油酵母可用于高效生产TAL，目前已通过异源表达2-吡喃酮合酶在解脂耶氏酵母中进行TAL合成，在280 h内滴度可达35.9g/L。 与解脂耶氏酵母相比，圆红冬孢酵母具有更大的底物范围与更高的甘油三酯滴度，但因为基因组序列未被注解和缺乏成熟的遗传操作工具而较少被研究 。

近日， 伊利诺伊大学香槟分校赵惠民实验室 在Biotechnology and Bioengineering发文：Metabolic engineering of oleaginous yeast Rhodotorula toruloides for overproduction of triacetic acid lactone，首次展示了工程化圆红冬孢酵母用于过量生产TAL的研究成果（DOI: 10.1002/bit.28159）。论文第一作者为曹名锋（目前任职于厦门大学），麻省大学洛威尔分校Dongming Xie等参与了研究。

首先，课题组将密码子优化过的来自非洲菊的2-吡喃酮合酶基因引入圆红冬孢酵母中，随后探究了 木糖、甘油、蔗糖、完全合成培养基和葡萄糖与木糖混合糖不同碳源底物对TAL生产影响 ，结果表明YPD培养基更利于TAL的生产；此外有研究表明醋酸盐有利于酿酒酵母和解脂耶氏酵母中乙酰辅酶A供应和TAL合成，因此课题组分别测试 在YPD培养基中补充0.5%、1%和2%醋酸盐，发现2%的醋酸盐可增加TAL产量80%。

在TAL的合成通路中，2-吡喃酮合酶可催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的缩合，为了探究TAL过量生产的限制性前体，课题组分别过表达内源性乙酰辅酶A羧化酶ACC1提高丙二酰辅酶A产量和引入第2轮基因组整合的2-吡喃酮合酶基因，发现TAL生产仅分别提高6%和11%，因此课题组推测TAL过量生产的限制性前体是乙酰辅酶A。

为了增强乙酰辅酶A的生物合成途径，课题组分别测试三种不同的代谢工程策略，分别是（1）过表达丙酮酸脱氢酶的亚基E1和E3；（2）过表达丙酮酸脱氢酶旁路途径相关的丙酮酸脱羧酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶 A 合成酶；（3）过表达柠檬酸盐途径的ATP-柠檬酸裂解酶ACL1。结果发现通过策略（3）过表达ACL1基因，TAL产量可显著提高45%，在120 h达到 6.6 g/L，约为35%的理论产量。接着，课题组探究多靶点工程提高TAL产量，发现乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1的过表达可在策略（3）的基础上额外提高29%产量。

最后，在以补充 醋酸盐的葡萄糖或甘蔗汁为底物 下，在生物反应器中发酵，分别可达28 g/L和23 g/L的TAL滴度，虽然发酵产量相对于解脂耶氏酵母中最高产量偏低，但是体积生产率（分别是0.24 g/L/h和0.19 g/L/h）均高于解脂耶氏酵母（0.12 g/L/h）。

综上，课题组通过异源表达2-吡喃酮合酶基因，并利用代谢工程策略，在圆红冬孢酵母实现了高产TAL。这将为开发圆红冬孢酵母细胞工厂合成聚酮或其它乙酰辅酶A衍生化合物提供参考。