西北农林科技大学和文祥STOTEN：以土壤酶Vmax指标评价土壤中低环多环芳烃的生态毒性

多环芳烃（PAHs）因其毒性高、持久性强、迁移范围广、生物蓄积性强等特点引起了人们的广泛关注。萘（Nap）和蒽（Ant）作为低环多环芳烃的典型代表，在石油产品加工过程中排放量最大。此外，Nap和Ant对微生物和土壤酶有严重危害，破坏了土壤中正常的物质循环。荧光素二乙酸酯水解酶（FDA水解酶）是土壤微生物活性和质量变化的可靠生化生物标志物。然而，低环多环芳烃对土壤FDA水解酶的影响及其机制尚不清楚。本文研究了萘（Nap）和蒽（Ant）两种典型的低环多环芳烃对6种不同性质土壤中FDA水解酶活性和动力学特性的影响。

Nap和Ant在不同浓度下对供试土壤FDA水解酶活性有抑制作用。无Nap处理土壤的FDA水解酶活性（9.76 ~ 39.01 μg ⁻¹ h ⁻¹ ）是1000 mg kg ⁻¹ Nap处理土壤（3.62 ~ 38.11 μg ⁻¹ h ⁻¹ ）的1.02 ~ 3.12倍。无Ant处理（10.09 ~ 37.16 μg ⁻¹ h ⁻¹ ）土壤酶活性是100 mg kg ⁻¹ Ant处理（2.87 ~ 22.66 μg ⁻¹ h ⁻¹ ）土壤酶活性的1.64 ~ 3.87倍。因此，Ant对土壤FDA水解酶活性的抑制率远高于Nap。当Nap浓度从50 mg kg ⁻¹ 增加到100 mg kg ⁻¹ 时，FDA水解酶活性的抑制率从2.62% ~ 10.96%增加到8.19% ~ 24.52%。当Ant浓度从2.5 mg kg ⁻¹ 增加到5 mg kg ⁻¹ 时，FDA水解酶活性的抑制率从4.45 ~ 15.30%增加到8.29 ~ 34.19%。在Nap和Ant的最大浓度下，6种土壤的FDA水解酶活性分别下降了2.31 ~ 67.96%和39.01 ~ 74.15%。

图1 萘和蒽对土壤荧光素二乙酸酯水解酶活性的抑制率

Fig. 1 Inhibition rate of naphthalene and anthracene on soil fluorescein diacetate hydrolase activity

结果表明，6种土壤的FDA水解酶 V _max 值都随着Nap和Ant浓度的增加而降低。除S6外，FDA水解酶的 K _m 值也随PAHs浓度的增加而降低。当Nap和Ant浓度达到最大值时，土壤 K _m 分别减少了35.84 ~ 74.47%和74.00 ~ 91.61%。随着Nap浓度的增加，FDA水解酶的V _max /K _m 几乎没有变化，因为V _max 和K _m 具有相似的下降速率。而随着Ant的添加，只有S2、S4和S6的V _max /K _m 有降低趋势，当Ant浓度为100 mg kg ⁻¹ 时，其 V _max /K _m 分别降低19.45%、15.70%和37.61%。结合 K _m 和 V _max 的变化发现，Nap和Ant对供试土壤FDA水解酶的影响相似，表现为反竞争性抑制（土壤S6除外）。土壤S6在Ant污染下 V _max 降低， K _m 不变，表现为非竞争性抑制。

K _i 是酶-底物-抑制剂（ESI）复合物的解离常数，表示PAHs对酶-底物复合物的亲和力。较低的Ki表明ESI复合物的结合能力更强。NAP和Ant对FDA水解酶的K _i 分别为0.192-1.051和0.019-0.087 mM。在Ant污染下，除土壤S6外，K _i 小于无污染的K _m （2.34–6.03×10 ^-2 mM），表明ESI复合物的亲和力强于ES复合物。

图2 萘和蒽对土壤荧光素二乙酸酯水解酶动力学参数的影响

Fig. 2 Effect of naphthalene and anthracene on soil fluorescein diacetate hydrolase kinetic parameters

为了评估Nap和Ant对FDA水解酶的生态毒性，采用完全抑制模型拟合PAHs浓度与酶活性的关系及其与Vmax的关系。利用该模型计算了Nap和Ant污染下土壤FDA水解酶的ED ₁₀ 和ED ₅₀ 。根据FDA水解酶活性的降低，Nap污染下的ED10和ED50分别为43.92 ~ 203.55 mg kg ⁻¹ 和395.26 ~ 917.43 mg kg ⁻¹ 。相比之下，对于Ant污染，ED10和ED50分别为2.19 ~ 17.53 mg kg ⁻¹ 和19.75 ~ 69.40 mg kg ⁻¹ 。对于V _max ，Nap污染下的ED ₁₀ 和ED ₅₀ 分别为20.02 ~ 139.14 mg kg ⁻¹ 、180.18 ~ 684.93 mg kg ⁻¹ ，Ant污染下的ED ₁₀ 和ED ₅₀ 分别为1.30 ~ 20.81 mg kg ⁻¹ 、11.74 ~ 27.62 mg kg ⁻¹ 。通过V _max 计算的ED值小于酶活性计算得到的ED值。

Pearson相关分析进一步阐明了ED10（由 V _max 计算）、 K _i 和土壤性质之间的关系。结果表明，Nap的ED ₁₀ 和 K _i 与SOM含量呈正相关（p＜0.05）。这表明Nap对土壤FDA水解酶的毒性随有机质含量的增加而降低。此外，Ant的ED ₁₀ 和 K _i 与SOM和TN呈显著正相关，表明随着SOM和TN含量的增加，Ant与FDA水解酶-底物复合物的结合能力下降。此外，ED ₁₀ 与 K _i 呈极显著正相关。

图3 土壤荧光素二乙酸酯水解酶抑制参数与土壤性质的相关性研究

Fig. 3 Correlations between inhibition parameters of soil fluorescein diacetate hydrolase and soil properties

主成分分析（PCA）中，保留用于PCA分析的两个成分分别解释了总方差的72.8%和70.8%，其中PC1和PC2分别解释了39.8%、43.7%和33.0%、27.1%。在Nap污染下，土壤ED ₁₀ 、 K _i 、SOM、粉粒、NH ₄ ⁺ -N和CEC的PC1特征值均为正值（＞0.50）。在Ant污染下，土壤ED ₁₀ 、 K _i 、SOM、黏粒、NH ₄ ⁺ -N、TN和CEC的特征值为正值（＞0.50）。土壤性质与参数指标间的余弦值表明，SOM与ED ₁₀ 、 K _i 呈正相关。

图4 纳米塑料诱导水生生物的氧化损伤示意图

Fig. 4 Effects of nanoplastic exposure on oxidative damage induction in aquatic organisms

本研究揭示了FDA水解酶对低环多环芳烃急性污染的响应及其机制。结果表明，Nap和Ant对土壤FDA水解酶活性均有显著抑制作用，且抑制类型以反竞争性抑制为主。土壤FDA水解酶活性和V _max 均可作为评价多环芳烃毒性的指标，其中V _max 更为敏感。相关分析、逐步回归分析和主成分分析表明，SOM是影响两种多环芳烃对FDA水解酶毒性的主要因素，其主要通过影响多环芳烃与酶-底物复合物的结合，从而影响其对FDA水解酶的毒性。本研究为评价多环芳烃污染土壤的潜在环境风险提供了理论依据。