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科罗拉多矿业学院 Richard团队ACS Environ. Au：介孔硅纳米材料中固定化三嗪水解酶降解阿特拉津的研究

时间：2023-11-21 来源：浏览：

科罗拉多矿业学院 Richard团队ACS Environ. Au：介孔硅纳米材料中固定化三嗪水解酶降解阿特拉津的研究

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英文原题：

Atrazine Degradation Using Immobilized Triazine Hydrolase from Arthrobacter aurescens TC1 in Mesoporous Silica Nanomaterials

通讯作者： Brian G. Trewyn, Richard C. Holz，美国科罗拉多矿业学院;

作者： Karla Diviesti, Glory A. Russell-Parks, Brian G.Trewyn and Richard C. Holz

内容简介

美国科罗拉多矿业学院 Richard C. Holz 团队，首次成功将三嗪水解酶（TrzN）固定在介孔SiO ₂ 纳米材料（MSNs）上，并用壳聚糖予以包覆，制成生物材料TrzN:MSN-10:Chit，以便提高酶稳定性。该材料实现在极端条件下（20%MeOH存在下，低和高pH值以及80°C高温下）都拥有比未包覆材料更高的阿特拉津降解性能。

文章解读

当前，阿特拉津（2-氯- 4-乙胺-6-异丙基氨基-s-三嗪）已成为全球第二大的除草剂，每年用于高粱、甘蔗和玉米作物的用量约3万吨。阿特拉津具有水溶性可以抑制目标植物的光合作用，在水生环境中具有持久性和流动性。在美国，环境保护机构认定阿特拉津是一种人体内分泌毒素。 Arthrobacter aurescens TC1分泌的三嗪水解酶（TrzN，EC 3.8.1.8）是一种依赖于Zn（II）的水解脱卤酶，可催化阿特拉津转化为其毒性较小的衍生物羟阿特拉津（图1）。Richard C. Holz 团队在本研究中将三嗪水解酶固定在介孔二氧化硅纳米材料（MSNs）上，旨在保护酶在恶劣环境条件下的催化活性。介孔二氧化硅的多孔性不仅有利于底物和产物的扩散，允许有效的酶-底物相互作用，而且这些材料是高度可调的，因此它们可以适应各种酶和底物。此外，这些纳米材料的表面可以很容易地修饰，可得到定制的固定化策略和增强酶负载。

在这项工作中，Richard C. Holz 团队用Zn ²⁺ 功能化材料通过其N端组氨酸（His）共价拴住TrzN，与非共价蛋白负载材料相比，可以增加其稳定性。Zn ²⁺ /His-tag螯合是一种被广泛使用的生物偶联剂，因为His-tag内的咪唑基团具有很强的亲和力。因此，TrzN被非共价和共价固定在单分散二氧化硅微球中，提供了一种新型的生物催化纳米材料，能够在温和条件下水解降解阿特拉津。

图1. TrzN酶作用下阿特拉津水解成羟基阿特拉津

研究人员通过一系列表征技术得到了介孔二氧化硅纳米材料（MSNs）的物理性质。通过氮吸附分析计算得到其BET比表面积和BJH孔径（表1）。

表1.合成介孔二氧化硅纳米材料（MSNs）的性质

研究人员评估了三种孔径对5 mg具有催化活性的纯TrzN的固定化能力：MCM-41（小，3 nm）、MSN-10（中等，6-12 nm）和PEMSN-10（大，15-30 nm）（表1，参见附件材料中N2 吸附等温线，XRD和ICP数据）。对于小孔径的介孔二氧化硅纳米材料，未功能化材料的TrzN含量为37.1±0.4%，而Zn（II）功能化材料的TrzN含量为99.6±0.2%。对于中等孔径的材料，固定化蛋白占比24.2±0.3%，而Zn（II）功能化材料则固定了98±0.1%的蛋白。最后，非功能化的PEMSN-10固定了36.7±0.0%的蛋白质，Zn（II）功能化材料固定了99.2±0.1%的蛋白质。蛋白负载通过采用用Coomassie （Bradford）蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific）计算负载缓冲液中的蛋白量与固定步骤后剩余蛋白量之间的变化来确定。功能化和非功能化的固定化TrzN的MSNs均能与50 μM的阿特拉津在50 mM HEPES 缓冲液（pH 7.0）中反应，在25℃下反应1 h，记为1个反应周期。在5个反应周期内评估观察到的反应情况见图2。由图可见，三种孔径中，中等孔径材料固定化酶TrzN:MSN-10效果最佳。

图2. 在25°C，50 mM HEPES缓冲液中，pH 7.0, 每周期1 h情况下下固定化特定活力强度trzN酶的MSNs对50 μM阿特拉津降解情况。使用负载trzN的功能化和非功能化MSN为: MCM-41（小，3~3.5 nm，黑色），MSN-10（中，6~12 nm，红色）和多孔MSN-10（大，15~30 nm，蓝色）。Zn（II）功能化的TrzN: msn用圆形表示，未功能化的TrzN: MSNs用方形表示。

Richard C. Holz 团队将TrzN: MSN-10生物材料表面用壳聚糖进行包覆得到TrzN: MSN-10: Chit，结果表明，在50 mM HEPES缓冲液中，在25°C, pH 7.0，与50 μM阿特拉津反应1小时，反应后没有检测到蛋白损失（图3）。与未采用壳聚糖进行包覆的TrzN: MSN-10生物材料相比，TrzN: MSN-10: Chit 生物材料的活性为94±4%，表明添加的壳聚糖涂层对TrzN水解阿特拉津的能力几乎没有影响。这些数据表明，TrzN: MSN-10 和TrzN: MSN-10: Chit 生物材料在溶液中均表现出预期的酶学特性，包括底物识别。

Richard C. Holz 团队考虑到生物催化剂必须可重复使用并具有长期稳定性在多种可重复使用条件下对TrzN: MSN-10和TrzN: MSN-10: Chit生物材料进行了研究。生物催化剂在随后的反应中被循环多次。材料在5个1小时的循环中测试，循环之间没有洗涤步骤。两种材料在连续五次反应中都保持完全活性，没有可计量的蛋白质损失（图3）。壳聚糖涂层很可能通过防止氨基酸在储存过程中的变性来增加生物催化剂的稳定性。两种材料三种不同的储存条件下（4°C干燥（无缓冲液）；1 mL 50 mM HEPES缓冲液，pH 7.0, 4°C，湿；-80°C，干）壳聚糖涂层处理中TrzN的活性可稳定保存6周，显著优于未进行壳聚糖涂层处理的对照（图4）。

图3. TrzN: MSN-10（黑色方块）和TrzN: MSN-10: Chit（浅蓝色圆圈）的循环可重用性。通过监测50 μM阿特拉津在25°C和50 mM下的水解，在5个循环中进行评估HEPES缓冲液，pH 7.0，持续1小时。每个点代表5个1小时的循环，循环之间没有洗涤步骤。

图4. TrzN:MSN-10（黑色方块）和TrzN:MSN-10:Chit（浅蓝色圆圈）在六周内的长期稳定性。50 μM阿特拉津在50 mM HEPES缓冲液中，pH 7.0, 25℃下水解1 h。。每种生物催化剂洗涤后，在4°C下保存在1ml 50 mM HEPES缓冲液中，pH 7.0，每周从缓冲液中取出分析。

研究还发现，TrzN: MSN-10: Chit生物材料在有MeOH存在的HEPES缓冲液中的活性也要优于TrzN: MSN10（图5）。TrzN: MSN-10和TrzN :MSN-10: Chit生物材料在MeOH/HEPES共溶剂溶液中反应后，可以通过50mm HEPES （pH 7.0）洗涤生物材料而部分恢复活性（图5，插图），尤其当洗涤液中甲醇浓度达到30%时，两种生物材料几乎可以完全重新激活。在较高的MeOH浓度下，TrzN:MSN-10: Chit仍然可以被激活，但未包被的TrzN: MSN-10生物材料不能被激活。这些结果表明，TrzN: MSN-10: Chit中TrzN并没有被甲醇完全变性，可能是由于生物材料对蛋白质结构的稳定性保护。原理可能为将TrzN: MSN-10生物材料表面包覆壳聚糖，壳聚糖通过“锁定”酶的位置，进一步稳定了酶的结构，并提供了一个额外的保护屏障，免受MeOH的侵袭。

图5. 不同的MeOH浓度（0 ~ 100%）下TrzN:MSN-10（黑色方块）和TrzN:MSN- 10:Chit（浅蓝色圆圈）的活性对比。通过监测50 μM阿特拉津在50 mM HEPES缓冲液中，pH 7.0，在25°C下水解1 h。

插图: 分别与相应浓度的MeOH反应后，将TrzN:MSN-10（红色方块）和TrzN:MSN-10:Chit（红色圆圈）洗涤，并在标准条件下（即25°C, 50 μM阿特拉津，50 mM HEPES缓冲液，pH 7.0）反应1小时的活性情况。

作者还对TrzN: MSN-10和TrzN: MSN-10: Chit生物材料在非生理pH值下的稳定性进行了研究（图6），可见，壳聚糖包覆TrzN: MSN-10生物材料，提高了TrzN在非中性pH值（4和9）下的稳定性。

图6. 游离TrzN、TrzN:MSN-10和TrzN:MSN-10:Chit在50 mM柠檬酸缓冲液、pH 4.0或50 mM甘氨酸缓冲液、pH 9.0中，25°C 下对50 μM阿特拉津水解1小时的情况。星号表示没有检测到活性。

研究人员进一步验证了TrzN: MSN-10和TrzN: MSN-10: Chit生物材料的热稳定性（图7）。在50-80°C的温度范围内，使用30min热打击评价了两种生物材料的热稳定性。TrzN: MSN-10在60、70和80°C下分别表现出其原始活性的21±6、7±1和0%。而TrzN: MSN-10: Chit生物材料在相应条件下分别表现出其原始活性的43±2、32±3和34±6%，显著高于前者，可见壳聚糖涂层为TrzN提供了额外的热保护。原因可能是由于壳聚糖涂层在较高温度下稳定了与MSN-10结合的TrzN，这与先前的研究一致，壳聚糖涂层已被证明可增加固定化酶的热稳定性。

图7. 游离TrzN、TrzN:MSN-10和TrzN的热稳定性。记录50 μM阿特拉津在50 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）中，在50、60、70、80℃热休克30 min后，在25℃条件下水解1 h特定活性U/mg。星号表示没有可检测到活性。

该项目得到了National Science Foundation和National Institution of Health的支持。研究的相关结果已发表于 ACS Environmental Au 。

思考与启示

近年来，介孔纳米材料由于其结构可调、表面易修饰等优点而常用于各种酶的固定化，以期获得酶负载量大，环境稳定性高的固定化酶生物催化材料。本文的研究工作聚焦于介孔材料的孔径、表面功能化及保护性涂层包覆三个方面措施来增强阿特拉津水解酶TrzN固定化处理后的环境稳定性研究，通过三种孔径介孔二氧化硅材料（小，3 nm；中等，6-12 nm和大，15-30 nm）对比研究，确定了最佳的材料孔径范围；通过表面Zn ²⁺ 功能化及保护性壳聚糖涂层包覆，成功显著提高了水解酶的可重复使用性、有机溶剂共存、热和pH的稳定性，为开展酶固定化介孔纳米材料的结构调控、提高环境稳定性提供了重要参考，对研发性能优良的酶及微生物固定化材料具有较强的借鉴意义。同时，通过探明介孔纳米材料结构与其固定化酶的效果之间的“构-效”关系，表面功能化官能团或保护性涂层材料与酶之间的相互作用关系来指导研发酶负载量大、高稳定性的固定化酶生物催化材料也会是今后的研究前沿和热点。

* 感谢广东石油化工学院邓辅财老师撰写本文中文解读。邓辅财老师主要从事应用环境微生物降解有机物及修复有机污染土壤方面研究。

来源： ACS美国化学会。投稿、合作、转载、进群，请添加小编微信Environmentor2020！环境人Environmentor是环境领域 最大的学术公号 ，拥有 15W+活跃读者 。由于微信修改了推送规则，请大家将环境人Environmentor加为星标，或每次看完后点击页面下端的 “赏” ，这样可以第一时间收到我们每日的推文！环境人Environmentor现有综合群、期刊投稿群、基金申请群、留学申请群、各研究领域群等共20余个，欢迎大家加小编微信Environmentor2020，我们会尽快拉您进入对应的群。