色谱峰保留时间有波动原因汇总及解析
色谱峰保留时间有波动原因汇总及解析
PREP_2019
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写在前面
“保留时间是气相色谱法的常用术语，是指被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，当提到保留时间、死时间、调整保留时间时，你是否清楚？当涉及液相、气相中保留时间波动时，你又是否明白？
首先，什么是保留时间、死时间和调整保留时间？
1
从进样开始到某个组分的色谱顶点的时间间隔称为该组分的保留时间。即从进样到柱后某组分出现浓度极大时的时间间隔。
分配系数为0的组分的保留时间称为死时间。通常将空气或者甲烷视为此种组分，用来测定死时间。
3
某组分由于溶解（或者吸附）于固定相，比不溶解（或者不吸附）的组分在柱中多停留的时间称为调整保留时间；
调整保留时间=保留时间—死时间；（Vd）
在实验室条件下（温度，固定相等）一定时，调整保留时间仅决定于组分的性质，因此调整保留时间是定性的基本参数；
保留时间的波动的原因
一般而言，与如下因素有关： 1.操作因素； 2.色谱柱的质量； 3.仪器系统，尤其是输液泵的性能；
故障排除方法
引起保留时间不重复的最可能原因只有两个:
1.柱温不稳定；
2.流速有变化。
检测器的故障不会造成保留时间不重复,造成保留时间不重复的其它原因有进样技术不佳，进样量过大及柱损伤等。 排除保留时间不重复故障的步骤如下：
1.重复进样检查：
为了进一步证实保留时间不重复故障，应首先检查进样的重复性。在重复进样时最好由一人独立操作，这样能较好地解决进样时间的重复性问题；如果重复进样后保留时间仍然不能重复，则应转入下一步。
2.温控精度及程序升温重复性检查：
a.恒温分析时应首先检查柱室温度是否稳定在原分析操作所要求的设定值上。
b.必要时要检查柱室温度的稳定性，如设定值及实际柱温与原分析条件有偏差，应以原分析条件为准；
c.如果柱室温度在运行中有突然跳动，应进行温度控制故障检查与排除。
d.在应用程序升温的场合下，要检查程序升温过程起始、终止柱温及升温速率与原分析条件是否一致。
e.在检查时应注意，每次重新升温时，是否有足够的时间使起始温度保持一致，特别是起始温度很接近室温时，更应如此。
f.程序升温的升温速率可以通过先测定升温中始、终两点间所需时间值，然后用终温与始温之差除以该时间值而加以验证。
g.程序升温中还有一种情况不易为操作者所发现：那就是在升温过程中温度的变化很不均匀，忽快忽慢，但总的升温速率却看不出变化。
h.对此现象可采取记录程序升温曲线而加以比较。
i.如无自动记录方式可用手工法逐段加以记录，程序升温结束时再逐段加以对照，即可。
3.载气流速检查：
a.载气流速的改变是引起保留时间不重复的另一个重要原因。
b.可用皂膜流量计测定柱后或检测器之后的实际流速加以证实。
c.对于恒温分析来说，主要检测实测值与预定值之间的偏差，必要时重新调整设定值使流速达到预定值要求。
d.对于程序升温来说，必须检查温度处于始、终两点时载气流速是否有较大的变化。如果在始、终两点间流速之差超过2mL/s（当柱内径为4mm时）即认为稳流特性不好，这时需进一步检查系统是否漏气，稳流阀、稳压阀工作
e.压力是否合乎要求。
f.系统漏气不论对程序升温色谱，还是恒温色谱说来都是产生保留值不重复的一个不应忽略的原因。
g.在系统漏气中进样口隔垫的漏气是经常产生的，在高温操作下频繁进样时要注意及时更换。
4.色谱柱检查：
a.如果在气密性及载气流速方面均无异常，就应怀疑是色谱柱本身出了问题，对色谱柱进行检查。
b.首先注意色谱峰形有否拖尾，如拖尾则应减少进样量或稀释样品浓度，以免色谱柱过载。
c.如减少进样量后保留值重复性提高，则说明原柱固定相有少量流失或充填欠佳；此时原色谱柱还仍能使用。
d.如果上述方法也无效，则说明色谱柱已发生损坏，必须更换新柱子。
如何锁定保留时间
所谓保留时间锁定，就是使特定化合物的保留时间在不同仪器、不同色谱柱（但标称固定相和相比相同）之间保持不变。为了讨论这一技术的基本原理，要从影响保留时间重现性的因素说起！
决定保留时间的因素都有啥？
化合物的性质、固定液的性质和操作条件；
如果前两个因素不变（对于特定的化合物和GC仪器系统，这当然是成立的）；
只有操作条件会变，即，载气流速、柱温、毛细管柱规格和检测器类型等；
1.载气控制：
对于同种载气来说，压力和流速是影响保留时间的参数；
不同厂家的压力表和流量计的制造精度有所不同，故当不同仪器的压力和流量显示完全一致时，柱内流量也不尽相同；
现在有了EPC，这一问题基本得到了解决；
虽然同一厂家制造的EPC不可能每项都严格一致，但差异微小，通过压力的自动调节完全可以补偿这一差异。
2.温度控制：
保留时间对温度极为敏感，过去采用水银温度计测量柱温时，重现性显然有问题。现在都用热敏元件与电子线路来控制温度，精度大为提高。不同仪器间温度重现性令人满意。即使有0.5℃的温度差异，我们仍能通过调节柱前压的办法来使保留时间达到重现。
3.色谱柱规格：
不同厂商的色谱柱，尽管标称规格一致，但难免有内径的不均匀、固定液膜厚的变化、以及柱长的不精确，这些都会造成保留时间的波动。
同一根色谱柱在使用过程中会发生变化，比如，重新安装或因柱污染而截去1～2cm后，若其他操作条件不变，保留时间就不能重现了。
目前，同一厂商的色谱柱制造重现性已相当高，而不同厂家的色谱柱尚不能完全重现，尤其是极性柱。但我们如果采用同一厂家的色谱柱，就可基本解决这一问题。至于色谱柱长度的变化，可以通过调节柱前压来补偿。
保持保留时间的重复性依然是重中之重！同时，也要尽可能避免保留时间的漂移！锁定保留时间技术也值得不断探索！
保留时间波动不外乎：
1.操作因素；
2.色谱柱的质量；
3.仪器系统，尤其是输液泵的性能。
你有何 高见 ？
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基于中美药典及ICH指导原则的药品质量标准建立与分析方法开发验证培训班
时间： 09月15日-17日
地点：武汉市
课程概述
药物分析方法的建立和应用是药物研发和质量控制分析的核心内容。伴随着法规对产品及其生产工艺生命周期管理的要求，制药企业如何从分析方法生命周期的角度开发高效的分析方法并应用于质量控制分析，是摆在全球制药行业研发和质量管理层面前的重要问题。为 此， 我们定于 202 3 年 09 月 15 日 -17 日 在 武汉市 举办 “ 基于中美药典及 ICH 指导原则的药品质量标准建立与分析方法开发验证培训班 ”，
课程时间安排
09月16日
9:00-12:00 13:30-16:30
基于中美药典与
ICH
指导原则的药品质量标准建立规范化过程解析
一、如何依据中美欧药典及
ICH
指导原则确定质量标准研究内容
1
制剂通则规定及制剂特性要求
2
质量研究与制备工艺研究、稳定性研究之间的关系
二、如何依据中美药典与
ICH
指导原则建立分析方法
1
根据选定的研究项目及试验目的确认被选择分析方法所要达到的目标
2
原料药及制剂生产分析方法选择及质量控制
3QbD
分析方法设计与产品质量控制
4
原料药和制剂特性品质的建立
三、如何依据中美药典与
ICH
指导原则确定质量标准的项目及限度
1
残留溶剂限度控制及限度制定依据
2
杂质和降解产物的控制及限度设置
3
举例说明：①原料药的进厂检验标准的制定；②进口药品注册标准的起草；③放行标准与货架期标准的比较等
四、如何撰写符合中国药典格式的质量标准
1.
不同研发阶段的质量标准制订关注点
2.
依据中国药典的规范用语及格式制订出合理、可行的质量标准
3.2020
版药典中关于色谱法新体例格式解读等
4.
实例说明质量标准叙述中应注意的问题
主讲人：张老师 北京市药品审评专家，北京药监局新药研制现场核查专家， CFDA 高级研修学院客座讲师。在北京市药品检验所任职近 30 年，主要负责药典标准的起草和复核、国内新药的审批以及进口药品的质量标准复核工作。
09月17日
9:00-12:00 13:30-16:30
基于
ICH
指导原则
的分析方法
开发
验证
一、
ICHQ14分析方法开发要求细读与启示
1）
引言
-Q14背景、关键原则、指南目的、期望的获益
；
2）分析方法目标配置文件(ATP)研究；
3）分析方法开发和持续改进的知识和风险管理 ；
4）分析方法耐用性和参数范围的评价 ；
5）分析方法控制策略-分析方法既定条件；
6）分析方法生命周期管理和批准后的变更；
7）开发多变量分析方法
8）开发实时放行检测分析方法-特殊考虑
9）分析方法相关信息的提交
10）实例分析
例
1 小分子药物中作为特定工艺有关杂质的异构体测量
例
2 抗肿瘤坏死因子 α 单克隆抗体的效价测量
二
、基于
USP与ICH的分析方法验证
1)
方法验证基本要求
1 分析方法验证适用范围 2.分析方法的生命周期管理
3 可报告范围确定 4 稳定性指示方法 5 多变量分析方法
2)
分析方法验证的主要内容及关键要点
1专属性评估，多种方法验证方法的专属性
2准确度实验设计原则和可接受标准
3精密度实验设计原则和可接受标准
4 工作范围确定
4.1 校准模型建立 线性或非线性和范围设计的基本原则
4.2 低范围限的验证，检测限和定量限的评估
5方法耐用性的设计和评价
6 系统适用性试验的选择
3）
《分析方法确认指导原则》解读
4）
《分析方法转移指导原则》解读
主讲人：王老师 原省药检验院副院长、主任药师
会务费
培训费： 2600 元 / 人，包含 ( 专家费、资料费、场地费、现场问答等 ) 。食宿统一安排，费用自理。（ 团队报名可享优惠，朋友圈积攒最多可优惠1000元/人 ）
培训报名联系人 ： 王老师
微信/手机：15506140531（微信同号）
会议培训汇总
| 地点 | 时间 | 会议主题（如需了解详情请点击文字链接查看） |
| 上海 | 8 月25-27日 | 【上海】基于OECD-GLP：质量保证QA专题互动问答一对一指导 |
| 线上 | 9 月15-16日 | 【线上】稳定细胞株开发的全流程解析 |
| 武汉 | 9 月15-17日 | 【武汉】基于药典及ICH指导原则的药品质量标准建立与分析方法开发验证 |
| 线上 | 9 月21-22日 | 【线上】医药工厂节能降耗管理体系建立及实际改善方案 |
| 成都 | 9 月22-24日 | 【成都】新药研发项目经理十项核心技能进阶（4800元3人） |
| 线上 | 9 月23-24日 | 【线上】研发质量体系构建中关键要素及研发QA能力提升 |
| 线上 | 9 月23-24日 | 【线上】药物非临床安全性评价项目负责人 |
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