用于分枝杆菌碱基编辑的PAM扩展型嗜热链球菌Cas9 C到T和C到G碱基编辑器 | Engineering

结核病是单一传染性疾病的主要死因之一，2018年，全球共有1000万人感染结核分枝杆菌，其中共有145万人因此死亡。耐药结核病的治疗指南提出，结核病患者需要同时使用4种一线药物进行6个月的治疗。此外，耐多药结核病和完全耐药结核病的病情日益严重，给结核病治疗带来了巨大的困难。结核分枝杆菌（MTB）耐药性是临床治疗面临的重大挑战，迫切需要开发治疗耐药结核病的新型策略，而简单易用的MTB遗传操作方法能够加速这一进程。依赖于规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）的碱基编辑器能够快速有效地进行碱基编辑和基因失活，然而，目前还没有开发出可用于MTB的碱基编辑器。

南京中医药大学陈伟研究团队、上海科技大学季泉江研究团队在中国工程院院刊《Engineering》2022年8月刊发表了题目为《用于分枝杆菌碱基编辑的PAM扩展型嗜热链球菌Cas9 C到T和C到G碱基编辑器》的研究性文章，通过筛选不同的碱基编辑器，发现广泛使用的酿脓链球菌CRISPR相关蛋白9（SpCas9）或毛螺科菌Cpf1（LbCpf1）胞嘧啶碱基编辑器在分枝杆菌中不具有活性，而嗜热链球菌Cas9（St1Cas9）胞嘧啶碱基编辑器活性较好。虽然使用St1Cas9胞嘧啶碱基编辑器能够实现C到T的碱基编辑，但是在碱基编辑过程中却产生了大量的副产物。将尿嘧啶- N -糖基化酶抑制剂或尿嘧啶- N -糖基化酶分别融合到St1Cas9胞嘧啶碱基编辑器中，得到了两种新的碱基编辑器——CTBE和CGBE，能将C分别转化为T或G。将CTBE和CGBE用于耻垢分枝杆菌的基因编辑时，产物的纯度得到了提高，并且能够进行多位点编辑。此外，由于野生型St1Cas9在靶向DNA序列时需要识别严格的前间隔序列邻近基序（PAM），因此文章通过结构介导的蛋白质工程设计了PAM扩展的St1Cas9，扩大了碱基编辑器的靶向范围。文章首先在耻垢分枝杆菌中测试了CTBE和CGBE的编辑效率，随后测试了CTBE在MTB中的编辑效率。文章提出的方法显著减少了在MTB中进行精确遗传操作所需要的时间，并将推动分枝杆菌功能基因组学、抗生素-耐药性机制研究和药物-靶点研究的发展。

文章指出，遗传操作对于结核分枝杆菌生物学研究和药物靶点的探索具有重要意义。在结核分枝杆菌中进行无痕、精确且无标记的基因编辑方法需要依赖同源重组修复，且需要耗费数月到一年的时间。CRISPR辅助的同源重组修复方法已经被用于在多种细菌中进行快速和精确的基因组编辑。然而这一方法并不适用于结核分枝杆菌，可能是因为结核分枝杆菌中缺乏与CRISPR兼容的同源重组修复系统。利用催化失活的St1Cas9、SpCas9或新杀弗朗西斯菌Cas12a（FnCas12a）的转录抑制（CRISPRi）系统已经被开发用于分枝杆菌的基因沉默。然而，这些系统只能实现部分基因的敲除，并且会产生极性效应，使Cas蛋白结合位点下游的基因也被沉默。

为了解决分枝杆菌基因编辑中的问题，文章开发了高效的PAM扩展型St1Cas9从C到T和从C到G的碱基编辑器，用于分枝杆菌的碱基编辑。这些系统可以通过一个转化步骤实现精确的单碱基替换，从而大大减少遗传操作所需的时间和劳动。可被CRISPRi系统极性效应沉默的Cas蛋白结合位点下游基因的表达不会受到碱基编辑系统的影响。此外，碱基编辑系统可以进行高效的多基因编辑，因为在生长缓慢的病原体中对多个基因逐步进行编辑是非常耗时的。由于靶向基因组位点只需要20个核苷酸的spacer，除用于单基因编辑外，该系统还可以进一步改造成高通量基因敲除筛选方法，这种方法将有助于系统地发现新的药物靶点，促进分枝杆菌治疗新方法的开发。

关键词：

CRISPR ; Cas9 ; 结核分枝杆菌 ; 基因编辑 ; 碱基编辑

以上内容来自：Hongyuan Zhang, Yifei Zhang, Wei-Xiao Wang, Weizhong Chen, Xia Zhang, Xingxu Huang, Wei Chen, Quanjiang Ji. PAM-Expanded Streptococcus thermophilus Cas9 C-to-T and C-to-G Base Editors for Programmable Base Editing in Mycobacteria [J]. Engineering, 2022, 15(8): 67-77.