华理许建和：获NADH再生强于葡萄糖脱氢酶的异丙醇脱氢酶突变体

氧化还原酶是合成各种手性分子的一类重要生物催化剂，其辅因子通常为不稳定且昂贵的NAD(H)/NADP(H)。辅因子再生策略是解决生物催化过程中辅因子不稳定和/或昂贵的常用手段。 异丙醇脱氢酶 (Isopropanol Dehydrogenase, IPADH)具有再生NAD(H)/NADP(H)的潜力，但异丙醇脱氢酶热稳定性差且特异性的以NAD(H)做辅因子，阻碍了其在辅因子再生中的应用。

近日， 华东理工大学许建和团队 通过半理性设计改造异丙醇脱氢酶获得两个突变体IPADHM3：40°C半衰期提高433倍、活性提高3.3倍；IPADHM4：能特异性以NADP(H)作为辅因子，文章发表于 Applied and Environmental Microbiology 题为：Engineering Isopropanol Dehydrogenase for Efficient Regeneration of Nicotinamide Cofactors。

通过底物对异丙醇脱氢酶进行筛选，研究者筛选到对异丙醇具有氧化活性同时对丙酮具有还原活性的猪布鲁氏杆菌异丙醇脱氢酶，其以NAD(H)作辅因子且在40 °C时半衰期为19 分钟，不能满足实际应用需要。

为提高其热稳定性，研究者通过与同源耐热酶进行多序列比对，推测比对结果所显示的9个保守氨基酸与热稳定性相关，对这些位点进行定点饱和突变，发现R48L突变体IPADHM1可将温度半衰期提高6.9°C。

为进一步提高其热稳定性，研究者通过对已解析结构的apo-异丙醇脱氢酶的温度因子进行分析，发现了两个可能与温度稳定性相关的柔性片段。通过局部序列比对，识别了多种温度稳定性较好酶的相关柔性片段，并将这些片段“替换”入IPADHM1的对应位置，结果表明将193-200位氨基酸残基替换为色链霉菌羰基还原酶柔性片段的突变体IPADHM2活性提高了1.5倍，半衰期温度提高10.4°C。

为进一步探究所“替换”位置每一个氨基酸残基的作用，研究者对替换后的氨基酸残基进行回复突变，结果表明193、199位回复突变后活性和热稳定均大幅降低，因此对此193、199位的“替换”进行保留，综合上述结果研究者构建了R48L、N193T、K199Y突变体IPADHM3，其在40°C时半衰期提高433倍。

为将IPADH辅因子拓展至NADP(H)，研究者通过与具有严格NADP(H)辅因子依赖的脱氢酶进行多序列比对，结果表明36、37、38位氨基酸残基较为保守推测与辅因子选择有关，通过对此三个氨基酸为点进行定点突变建库，筛选到D36G、F37R、S38G突变体IPADHM4，其能以NADP(H)做辅因子且特异性为NAD(H)的1.26x106倍，但半衰期温度降低至34.6°C。

进一步利用亮氨酸脱氢酶、类固醇脱氢酶对IPADHM3的NAD(H)再生能力进行测试，相较于葡萄糖脱氢酶和乳酸脱氢酶其再生能力更强；Baeyer-Villiger 单加氧酶对IPADHM4的NADP(H)的再生能力进行测试，相较于甲酸脱氢酶其再生能力更强。

综上，研究者通过同源序列比对识别关键氨基酸残基和柔性片段替换等半理性改造猪布鲁氏杆菌异丙醇脱氢酶获得突变体IPADHM3其40°C半衰期提高433倍、活性提高3.3倍；突变体IPADHM4可特异性以NADP(H)做辅因子，拓展了NAD(H)/ NADP(H)再生工具酶的选择。