NC | 空间蛋白质组学揭示神经病变相关的TECPR2引起的分泌通路紊乱

大家好，今天和大家分享一篇 2023 年发表于 Nature Communications 期刊的研究论文， Spatial proteomics reveals secretory pathway disturbances caused by neuropathy-associated TECPR2 ，通讯作者是来自德国慕尼黑大学的 Christian Behrends 教授。

研究背景：

遗传性感觉和自主神经病变（ HSAN ）是罕见的神经发育与退行性疾病，这一常染色体疾病的基本临床特征表现为全面发育迟缓，智力低下。近期研究发现该种疾病的亚型 HSAN9 主要是由于 TECPR2 蛋白的基因突变引起，目前缺乏特异性靶向 TECPR2 蛋白 N 端的抗体，因此对这一突变体（ L440Rfs*19 ）的功能影响与稳定性知之甚少。 TECPR2 蛋白与 COP Ⅱ载体的核心 SEC24D 紧密结合，并在结合相关研究的基础上提出 TECPR2 在自噬中的重要作用可能与其从内质网出口（ ERES ）至高尔基体运载蛋白相关，并作出本篇研究加以验证。

研究结果：

HSAN9 截断型 TECPR2 改变了 ERES 的组成及局部环境：

由于缺乏特异性 N 端抗体，作者采用 CRISPR/Cas9 技术构建携带 TECPR2 框架的移位突变 293T 细胞来模拟突变体 L440Rfs*19 带来的生物学影响，见图 1a 。随后作者采用 APEX2 邻近生物素化标记技术探索 TECPR2 对 ERES 组成带来的影响，蛋白质组学中分析到 1070 个趋势蛋白，在可视化分析中观察到野生型（ WT ）与突变型（ MUT ）间蛋白存在显著性差异，见图 1b-e 。

在全局蛋白质组学分析中发现， MUT 细胞中的 SEC24C 与 SEC13 阳性点显著降低，这与此前 RNAi 及免疫荧光实验结果吻合，在 MUT 细胞中补充 HA-tag 的 TECPR2 WT 可以回调上述两种蛋白的丰度，见图 1f ，图 2a-b 。 在病人的成纤维细胞中也观察到上述两种蛋白阳性点的骤减，且 COP Ⅱ亚基共定位数量也减少，预示截断的 TECPR2 与 ERES 崩解相关，见图 2c-e 。 验证了部分与神经性疾病相关的阳性靶蛋白，在免疫印迹分析中发现截断体细胞中存在显著邻近生物素富集变化，且 SPG20 、 NEK9 和 BAG2 缺乏明确的信号肽，并在保护实验中发现其对蛋白酶敏感，说明这些邻近蛋白不应是分泌蛋白，见图 2f-i 。 综上， ERES 的组成与维持需要全长表达的 TECPR2 ，并受 HSAN9 相关的 TECPR2 调控。

Figure 1. Mutant TECPR2 alters the assembly and proximity of ERES components.                           Figure 2. ERES disintegrate in TEPCR2 deficient cells.

HSAN9 截断的 TECPR2 影响 ER 及 COP Ⅱ运载：

大多数蛋白质从内质网转运至高尔基体需要 COP Ⅱ包裹运输，于是作者接下来模拟在 HSAN9 截断的 TECPR2 细胞中运输受损的 COP Ⅱ依赖性货物蛋白。采用 RUSH （ retention using selective hook ）结合蛋白酶保护加强型 APEX2 技术描绘 COP Ⅱ的运载蛋白，就是将 APEX2 接在基于 α - 甘露糖酶Ⅱ的 RUSH 系统 C 端（ MAN2A1-SBP-GFP ）见图 3a 。在 RUSH 系统与定量分析中可看到与结果，从内质网向高尔基体转移的行为在 MUT 细胞中显著降低，见图 3d-e 。蛋白质组学分析发现， WT 细胞中在标记 5min 后已经捕获大多数生物素化蛋白，而 MUT 细胞中在标记 30min 时才富集到相关生物素化蛋白， GO 分析发现 MUT 细胞中的候选蛋白主要富集在“ ER ”或“ secreted ”，明确了在模拟 HSAN9 条件下截断体 TECPR2 能够延迟蛋白由内质网向高尔基体运输。

综上， RUSH 系统结合 APEX2 能够描绘 COP Ⅱ运载蛋白谱，并系统性认识被截断体 TECPR2 所影响的从 ER 出口随后转运的 COP Ⅱ的候选运载蛋白。

Figure 3. Mutant TECPR2 affects ER exit and trafficking of COPII cargo.

HSAN9 型截断 TECPR2 改变了细胞表面蛋白质组与分泌组：

在完成上述实验后，作者提出截断体 HSAN9 截断型 TECPR2 对分泌蛋白运输的影响到何种程度，这里采用点击化学（ click-chemistry ）与代谢标记糖蛋白生物素化的方法富集表面蛋白与分泌蛋白。蛋白质组学分析发现， TECPR2 MUT 细胞与 HA- TECPR2 L440Rfs 表达细胞丰度变化大的蛋白相似，都指向截断 TECPR2 不足以完成其在分泌通路中的功能， GO 分析也指出 TECPR2 MUT 细胞中表面组与分泌组的神经元注释显著减少，见图 4a-f 。 c lick-chemistry 与 COP Ⅱ描绘谱数据比对发现，蛋白注释层粘连蛋白、纤维连接蛋白、 EFG 样与 PSI 样结构域更容易受截断体 TECPR2 影响，见图 3i ， 4e-f 。

综上，蛋白质组学表明，由于早期的分泌过程受到截断体 TECPR2 的干扰，在模拟疾病的细胞模型中，货物蛋白最终转运到的位置也受到了严重影响。实验数据也映射出内质网输出缺陷与 HSAN9 患者的神经发育退行性病变的潜在联系。

Figure 4. Cell surface proteome and secretome composition changes upon  expression of mutant TECPR2.

HSAN9 型截断 TECPR2 影响溶酶体的组成 ：

溶酶体也是早期分泌途径的目的地之一，且研究表明 TECPR2 缺失能够改变溶酶体的形态，于是作者希望能够阐明 TECPR2 依赖性分泌缺陷对溶酶体组成的影响。通过稳转 Flag/HA-TMEM192 在溶酶体中定位，蛋白质组学分析发现在 WT 细胞与 MUT 细胞发生显著差异变化的蛋白，两者差异蛋白 GO 富集分析通路相关性差，见图 5a-h 。 TECPR2 MUT 细胞中，研究中鉴定到的溶酶体蛋白与先前描述的自噬依赖性溶酶体比较， 没有显著的蛋白丰富变化，意味着截断体 TECPR2 能够引起内质网应激但不能诱导自噬。

研究证明模拟疾病的 TECPR2 细胞膜型中，溶酶体的膜组成及含量发生变化，这可能是溶酶体分泌途径运输中断的下游效应。

Figure 5. TECPR2 deficiency impacts the composition of lysosomes.

总结：

本研究中使用多种空间蛋白质组学方法来确定 TECPR2 缺失时蛋白质运输与分类的缺陷，并解释了 TECPR2 在 ER-Golgi 的顺利转运依赖于全长 TECPR2 蛋白。在建立的模拟疾病模型与病患成纤维细胞中观察到许多类似的细胞形态与相关分子生物学功能的改变，映射了 HSAN9 临床表现相关的神经元功能发育与维持的相关因素，为后续 HSAN9 及相关疾病提供了候选生物标志物与监测手段，进一步在分子层面解析疾病发病机制。