药物分析方法开发中对有关物质误判杂质峰的技术探讨

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目的    

探讨高效液相色谱法检查有关物质时容易被误认为是杂质的峰。方法 结合日常检验工作和相关文献,对易被误认为是杂质峰的进行了研究总结。结果 易被误认为是杂质峰的峰包括溶剂峰、有机酸盐峰、无机酸盐峰和辅料峰,并对这些峰的形成原因进行简单分析。结论 分析工作者在药物的有关物质高效液相色谱法的方法开发和检查,应对检验过程中出现的杂质峰予以重视,以免出现误判。

     

根据药品注册的国际技术要求中杂质的含义，杂质分为有机杂质、无机杂质和残留溶剂。有关物质是杂质的一种，主要是指有机杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料药前体、中间体、试剂、分解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物。

        

有关物质的检查方法很多，主要有薄层色谱法、高效液相色谱法（HPLC法）、气相色谱法和紫外分光光度法等。其中，HPLC法由于分离效果好、专属性强、灵敏度高，在有关物质检查中最为常用。在采用HPLC法对药物进行有关物质分析时，一般要求考察最大杂质峰面积或各杂质峰面积的和，将其与对照溶液的主峰面积（主成分自身对照品法）或总峰面积（面积归一化法）比较，规定应不超过某一特定的数值。但在实际检验过程中，排除配样引进或者是柱子没冲干净这些因素外，色谱图上仍然会出现保留时间较弱的峰，易被误认为是杂质峰，从而造成结果的误判。笔者结合日常检验工作和相关文献，选取了几个具有代表性的品种，将这些易被误认为是杂质峰的峰归纳为溶剂峰、有机酸盐峰、无机酸盐峰和辅料峰，并对这些峰的形成原因进行分析，以期对药物的有关物质HPLC方法的研究和常规检查提供参考。

1.溶剂峰

在HPLC法中，由于溶解对照品或供试品的溶剂和流动相在某一波长的吸光值不一样，因此产生了吸光值的变化，表现为出现溶剂峰。溶剂峰可能是正常形状的峰，也可能是倒峰，还有可能是一组奇形怪状的峰。减小该类溶剂峰最有效的方法是使用流动相作为溶剂溶解样品，这样既可以避免样品溶剂和流动相之间任何强度或黏度的不匹配，也可以减少样品分析时基线的漂移。

      

此外，值得注意的是，在进行有关物质分析时，要等基线平稳后，再进空白溶剂。一般进样2次，计算供试品溶液的杂质峰时，溶剂峰位置的峰是不参与计算的。

2.有机酸盐峰

      

《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2 0 1 5年版（二部）采用H P L C法对苯磺酸氨氯地平的有关物质进行控制。以甲醇-乙腈-0.7%三乙胺溶液（取三乙胺7.0 mL，加水至1000 mL，用磷酸调节pH值至3.0±0.1）（35:15:50）为流动相，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，检测波长为237 nm。标准规定：氨氯地平杂质I峰的峰面积乘以2与其他各杂质峰面积的和应不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（1.5%）。实际检测时，氨氯地平的出峰时间为17.5 min，但是在溶剂峰出峰的位置有响应较高的峰（保留时间3.0 min），色谱图见图 1。若将该峰判定为杂质峰，则会出现有关物质超标的情况。将苯磺酸配制成一定浓度进样后最终确定该峰为苯环酸的峰。也有研究采用液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用对苯磺酸的出峰予以确证。苯磺酸为一元有机酸，其pKa为0.7，在通常的流动相pH范围内，苯磺酸氨氯地平主要解离为氨氯地平阳离子（被质子化）和苯磺酸阴离子（C6H5SO3-），因此，苯磺酸氨氯地平会出现两个峰，一个是苯磺酸（保留时间较短），一个是氨氯地平。

同时，研究表明，采用反相HPLC法同时测定复方感冒药中的多种成分时，对马来酸氯苯那敏色谱峰的识别易出现判断错误，将马来酸的峰误认为是马来酸氯苯那敏。马来酸为二元有机酸，其pKa分别为2.00和6.26，在通常的流动相pH范围内，马来酸氯苯那敏主要解离为氯苯那敏阳离子（被质子化）和马来酸阴离子（HOOCCH=CHCOO-），因此，马来酸氯苯那敏也会出现两个峰。

在色谱系统开发过程中，一般会调节流动相pH，与目标化合物pKa相差2个单位以上，使药物全部解离或结合，这样才能准确定量。对于带有机酸根的化合物的液相检测，比如马来酸氯苯那敏、富马酸喹硫平、苯磺酸氨氯地平，在选择的流动相pH条件下，若目标化合物以离子型存在，则马来酸、苯磺酸和富马酸等有机酸也会以盐的形式存在，这些有机酸因含有共轭结构均有紫外吸收，从而在液相条件下也会出现一个色谱峰。因此，做此类物质的有关物质和含量测定时就应注意，不应将有机酸的峰误认为是杂质峰，或者是将有机酸的峰误认为是目标化合物的峰，造成结果的误判。

3.无机酸盐峰

《中国药品标准》采用HPLC法检测盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的有关物质。以硫酸铜D-苯丙氨酸溶液（取D-苯丙氨酸1.32 g与硫酸铜1 g，加水1000 mL溶解后，用氢氧化钠试液调节pH值至3.5）-甲醇（82:18）为流动相，检测波长为293 nm。标准规定，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积。实际分析时，在3.3 min出现一个很大的峰，色谱图见图 2。经过分析，认为与盐酸稀释后进样的峰位相同，因而在计算有关物质时不应将该峰误认为是杂质峰。

笔者在参与针对新版药典用的氢溴酸右美沙芬化学对照品的标化工作中，参照《中国药典》 中氢溴酸右美沙芬胶囊含量测定的方法，对氢溴酸右美沙芬进行有关物质检查，流动相为乙腈－磷酸盐缓冲液（取磷酸和三乙胺各5 mL，加水至1000 mL）（28:72），检测波长220 nm，实际检测时发现在2.5 min出了一个很大的色谱峰。为了验证该峰，用溴水稀释后直接进样分析，结果在同样位置出峰。见图 3。因此，在结果判定时，应注意不要误将该峰归纳入杂质峰。

类似于含有有机酸的药物，含有无机酸的药物在通常的流动相pH条件下也均会发生解离，以盐形式存在的化合物进入液相系统后会以游离碱的形式存在，盐酸和氢溴酸是强酸，也在流动相里解离形成氯离子和溴离子。肖欣等在对不同水中氯离子含量的比对分析中，用1 cm的石英比色皿，取一定浓度的氯化钠标准溶液作为待测液，采用紫外-可见分光光度计，扫描范围280~350 nm，确定了氯离子在波长为308.7 nm左右处有最大吸收。吕伟等研究也验证了溴离子在200~220 nm波长范围内有较强的紫外吸收。分析原因，可能是氯离子和溴离子有8电子的稳定结构而导致紫外吸收，具体原因还有待进一步分析。

【济南】基于化学创新药案例的药物分析人员关键岗位技能提升（5000元/3人）

主办单位

中国化工企业管理协会医药化工委员会

北京华夏凯晟医药技术中心

各有关单位：

药物分析与质量研究是新药研发中非常重要的部分, 药物分析工作自始至终伴随一个新药的开发，从临床前到临床期间直至N DA 上市，并且随着产品向前推进，质量研究越来越重要，在C DE 发布的“pre -NDA 会议申请中药学常见问题”里有7 0%都是药物分析相关。在项目申报中，由于质量标准等研究存在较大缺陷、前期研究不够充分，而导致与审评要求差距过大的情况尤为突出。所以，药物分析在新药研发中正发挥着越来越重要的作用，它是药品能够成功开发申报上市的关键。

根据当前新药研发形势的需要，为进一步夯实与提高药物质量分析人员的业务水平，为此 我单位邀请行业资深研发一线专家，通过对多个新药研发项目的质量研究内容及申报资料进行提炼，总结药物分析人员的核心知识体系，撰写案例模板，旨在帮助药物分析同仁系统提升岗位胜任力，经过课程学习后，可以快速拥有 整体把控新药开发中质量研究模块 的能力。

因此， 我单位定于 2023年11月7日-9日在济南 市举办“ 2023 基于化学 创 新药案例 的 药物分析人员 关键 岗位技能 提升 实操演练 ”研修班，详细通知如下：

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会议安排

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会议地点： 济南 市（具体地点通知给已报名人员）

会议时间： 20 23 年 11 月 7 日 - 9 日 ( 7 日全天报到 )

✦      主讲老师介绍     ✦

成 博士： 在大型医药集团研究院从事多年研发及管理工作， 10 年+ 药物分析 一线 实战经验，曾任药物分析研究员 、 分析经理 、 分析总监 、项目经理、 CMC总监等职 务，项目经验从申报临床、临床研究到上市各个阶段 。

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会议主要交流内容

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一、 药物分析在 新药 研发中的定位和价值

1.药物分析在工艺与制剂开发中的“眼睛”作用

2.药物分析在药品质量控制中的作用 

3.药物质量研究的全局鸟瞰图

4以CTD资料为终点反推药物分析工作流程

5药物分析失误带来进度、返工、效期、放行及发补等问题

二、 新药杂质研究整体的策略

1.基于QBD的杂质谱分析与控制策略制定（ 新药案例解析 ）

2.工艺杂质限度制定的指导原则解读 

3降解杂质限度制定的指导原则解读

4如何应对杂质 超出指导原则一般性规定

三、 API 与制剂有关物质方法开发与验证

1.液相分析方法开发的 2 0 个 关键要素解析( 药典案例与新药经验结合讲解 )

2.如何选择有代表性样品进行方法开发

3.如何高效提升分离度（流动相、色谱柱、柱温、梯度及流速优先级选择）

4.如何选择稀释液、供试品浓度、波长

5.如何做好方法洗脱全面性与专属性的确认

6.如何做好制剂样品前处理方法的筛选、辅料干扰的排除及回收率确认

7.新药有关物质方法开发 案例模板解析

8.新药有关物质分析方法验证 方案与报告模板解读

9.新药有关物质分析方法验证可接受标准对比分析

10.新药有关物质分析方法验证方案与含量、溶出度验证方案的比较

11.归一化、矫正因子与外标法的比较与选择

12.系统适用性设计的不同思路比较

13. 创新药不同研发阶段 质量研究要求差异分析

四、 新药A PI 与制剂 异构体方法开发

1.如何高效的分离异构体（流动相、色谱柱、柱温、添加剂优先级选择）

2.如何解决异构体方法灵敏度低的难题

3.新药 多个异构体 开发及控制策略 案例解析 （起始物料与中间体控制、手性方法与有关物质方法结合） 4.新药异构体限度制定思路

五、 新药 基因毒性杂质研究

1.满足申报要求的基因毒性杂质研究流程图及 新药案例解析

2.药物分析与工艺开发、毒理人员的协作

3.ICHM7指导原则的解读及实例介绍（适用范围、评估分类、控制策略）

六、 新药金属元素研究

1.基于ICHQ3D指导原则的金属元素风险评估模板解析

2.新药元素评估鱼骨图案例  

3.金属元素的控制策略及限度制定案例

七、 新药口服固体制剂 溶出度方法开发与验证

1.API溶解度系统测定的价值  

2.溶出度方法的选择

3.溶出转速的选择 

4.溶出度介质的选择 

5.溶出度检测时间点的选择

6.溶出均一性的确认  

7.溶出度开发报告 新药模板解析

8.新药不同研究阶段溶出方法及质量标准制定的策略

八、 新药 影响因素与稳定性研究

1.新药稳定性研究的风险点和控制策略

2.基于ICH指导原则的新药API和制剂稳定性检测项目的设计

3.新药降解杂质的分析、制备及限度依据研究

4.新药稳定性研究过程中分析方法变更研究

5.新药强制降解试验、预稳定性、影响因素及稳定性之间的协同

6.稳定性期间分析方法变更的研究要求

7.如何应对影响因素结果超标及物料不平衡

8.毒理样品稳定性的研究意义和方法

9.稳定性工作量大，如何提升效率抢进度

九、 新药质量标准制定的思路

1.新药外观与鉴别标准制定的思路和注意事项

2.新药理化检查项目标准制定的思路和注意事项（溶解度、引湿性、残渣、氯化物、粒径、晶型等）

3.新药注射剂常规检查项目标准制定的思路和注意事项（pH、溶液颜色、澄清度、不溶性微粒、可见异物、内毒素等）

4.不订入质量标准项目的思路与依据

5.新药不同研发阶段的质量研究要求

6.起始物料、中间体、辅料质量标准检测项目的设计与限度设定

7.质量标准制定依据 新药案例解析

十、 新药 C TD申报资料 质量研究模块 撰写思路

1.CTD资料整体撰写的原则：以审评者角度看数据整理与表达

2.CTD资料撰写的细节设计（ 新药案例模板解析 ）

3.如何运用图+表来提升资料质量

4.新药CTD资料分析部分与工艺、制剂模块协同撰写提升效率和统一性（ 如S 3 与S 4 ）

十一、 新药 分析方法转移与跨部门 沟通 协作

1.新药分析方法转移的策略介绍（起始物料、中间体、辅料、成本）

2.用差距分析工具降低转移失败风险（ 试剂品牌差异、设备型号品牌差异、空白干扰、天平差异、效期支持、偏差管理、计算公式 等）

3.方法转移的类别及方案介绍

4.跨部门（体系）沟通协作障碍的原因及应对策略

十二、 新药 分析 工作 与 相关模块的协作要点

1.新药分析与工艺开发的协同要点  

2.新药分析与制剂开发的协同要点

3.新药分析与药代、毒理及临床研究的交互关系4.新药分析与注册部协同

十三、 新药 研发 中 药物分析模块项目管理的要点

1.如何使分析工作是项目计划 不限速 环节

2.如何处理工作量集中人手不够

3.如何预测分析工作的 风险点 并科学应对

4.如何做好合规性及技术性的内部审评

5.WBS、PERT、project等项目管理工具的 新药实际案例 使用演示

十四、 新 药检测 结果异常 原因分析与解决 的逻辑思维

1.如何快速的排查鬼峰、空白干扰、含量偏差、回收率、物料不平衡等现象的原因

2.如何快速的分析含量均匀度不合格、稳定性结果波动、放行结果超出预期的原因

3.如何确认原因是否为 根本原因

4.如何针对根本原因采取治本的解决方案

5.新药检测问题分析与解决的 真实案例 演练

✦ 创新药 药物分析 岗位关键技能模型 ✦

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会议费用

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会务费：3000元/人，4000元/两人，5000元/三人（会务费包括：培训、研讨、资料等）；食宿统一安排，费用自理。为保证分组演练效果，培训限额60人.

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4.辅料峰

药用辅料是指在药品制剂中经过合理的安全评价的不包括有效成分或前体的组分。例如，在配制注射剂时，可以根据药物的性质加入适宜的辅料，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、组溶剂、抑菌剂和抗氧剂等，注射剂中所用到的辅料应在标签及说明书中说明。对于在HPLC法中会出峰的辅料，在对药物进行有关物质检测时，应扣除辅料峰的影响。

《中国药典》收载了利巴韦林原料及利巴韦林注射液，标准规定利巴韦林原料及其注射液中单个杂质的峰面积应不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍（0.25%），各杂质峰面积的和应不得大于对照溶液的主峰面积（1.0%）。研究发现，采用《中国药典》的方法检查利巴韦林注射液的有关物质时，对于加有氯化钠的利巴韦林注射液而言，氯化钠会在利巴韦林的杂质峰处同样出现吸收峰。文献报道，氯离子在200~220 nm范围内有较弱的紫外吸收，而且氯离子在磺酸型阳离子交换柱上存在离子排斥，故氯化钠在色谱柱上基本不保留，对有关物质检查干扰很大，故在有关物质检测时应排除氯化钠峰的影响，或者建议企业在利巴韦林注射液的处方中标注氯化钠的量或不加氯化钠以利于检测。

同时，在对硝酸甘油片有关物质研究中，建立了液质联用法确证了色谱图中保留时间2.8 min前的色谱峰为聚维酮K29/32的辅料峰，解决了硝酸甘油片质量标准中有关物质辅料峰的判定和扣除问题。在扣除辅料峰后，3批硝酸甘油片样品的有关物质结果均符合规定，为《中国药典》中硝酸甘油片质量标准修订提供了参考。

此外，《中国药典》收载的阿奇霉素分散片的有关物质检验明确规定了计算时予以扣除相对保留时间0.12之前的色谱峰为辅料峰，必要时应取辅料进行对照。研究表明，罗红霉素分散片中的辅料糖精钠的保留时间受仪器、色谱柱、流动相配比影响不大，在一定的流速范围内只根据保留时间就能很好地对其进行定性，在做有关物质检查时可以直接将其扣除。

国家药典委员会药典业化函8号文对杂质峰的问题作了如下规定：“杂质峰不包括溶剂峰和确认的辅料峰，药品说明书应列出制剂中所用辅料名称”。按照理解，已被确认的辅料峰在有关物质判定时不被认为是杂质峰，可以将其扣除。但将其扣除前必须对其进行研究，以确认其确实为某种辅料峰，而非辅料中的杂质峰，如无法确认是何种辅料则无法扣除。笔者建议，在制剂的有关物质方法开发中，也可以避开辅料存在的吸收波长，同时选取主成分和各杂质的特征波长，使辅料无吸收或有较低吸收，以消除或降低辅料峰的干扰；或者更改提取溶剂，利用药用辅料和主药的溶解性差异，在充分了解辅料和主药理化性质的情况下更换提取溶剂，将辅料峰降至最低干扰，以便可以忽略不计。

5.结语

药物中有关物质的研究是药物研发和质量控制的一个重要方面，贯穿于药品研究、生产和储存的整个过程。这就要求分析工作者对检验过程中出现的杂质峰予以重视，以免出现错误的结果。只有这样，才能真正使HPLC法测定有关物质的检验数据准确、可靠。

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