nature immunology｜肾癌患者瘤内部分耗竭性T细胞仍保留其效应功能

大家好，今天分享一篇 2023 年 4 月发表于 nature immunology 的文章，题为： Exhausted intratumoral Vδ2− γδ T cells in human kidney cancer retain effector function 。本文的通讯作者是 哥伦比亚大学医学中心微生物与免疫学系的 Donna L. Farber 教授 ，该课题组主要致力于机体免疫记忆的研究。

1.Pan- γδ 细胞分析显示肿瘤 Vδ2 ⁻ 细胞 表达 PD-1 和 4-1BB

为了阐明肿瘤中 γδT 细胞整体的免疫表型，作者对六组手术切除的肾细胞癌（ RCC ）进行了高参数流式分析（图 1a ）。力导向图显示， Vδ2 TCR 的表达是驱动聚类的主要因素（图 1b ）。根据单个样本中细胞的表型相似性进行降采后，作者确定了 17 个表型不同的种群（图 1d ）。 Vδ2 TCR 表达可分解 3 个 Vδ2+ 簇和 14 个 Vδ2- 簇，表明与 Vδ2- 细胞相比， Vδ2+ 群体的表型多样性较低。作者还发现，虽然在多个部位中可以发现几个簇，但簇 15 在肿瘤内特异性富集，几乎占肿瘤浸润的 Vδ2− 细胞总数的一半（图 1e ）。有趣的是，流式数据显示肿瘤中 Vδ2−T 细胞与正常肾组织相比显著富集，而簇 15 中高表达 PD-1 和 CD27 等标志物。  

图 1

考虑到 Vδ2+ 和 Vδ2− 细胞群之间显著的差异，作者分别对他们进一步分析。聚类分析显示驱动这两组细胞群聚类的因素均为记忆分化相关的标志物（例如， CD28 ， CD27 ， CD56 ， CD57 等）（图 2a ）。但 Vδ2+ 在各个组织均匀分布，而 Vδ2− 的分布具有组织异质性，脾脏中主要是效应细胞、 PBMC 和肺中主要是耗竭性细胞（图 2b ），而肿瘤组织中主要分布着第 5 类和第 9 类细胞（图 2c-d ）。这两类细胞主要是具有不同的 CD57 表达水平的 CD28+ 和 CD27+ 细胞，同时，他们还表达 αβ T 细胞中激活和抗原表达相关的标志物 PD-1 和 4-1BB （图 2a ， 2e-2f ）。

总之，这些数据表明， Vδ2+ 在肿瘤与非肿瘤组织间分布均匀，而 Vδ2− 细胞在肿瘤组织中高度浸润，且部分细胞呈现同时表达早期激活相关标志物（ CD28 和 CD27 ）和抗原刺激过的效应细胞标志物（ CD57 ， PD-1 和 4-1BB ）特殊表型。

图 2

2. 肿瘤 Vδ2 ⁻ 细胞表达抑制性受体的同时具备功能性

由于作者观察到部分肿瘤浸润性 Vδ2 - 表达 PD-1 ，作者进一步探究这些细胞是否表达 T 细胞耗竭相关的其他标志物。 RCC 患者肿瘤样本显示 Vδ2- 是肿瘤组织中 γδ T 细胞的主要亚群（图 2g ）。在 Vδ2+ 细胞群中， PD-1 ， TIGIT ， TIM3 的表达均较低，但 Vδ2- 细胞群高表达这些耗竭相关标志物，其水平与 CD8+αβ T 细胞 相当，且 TIGIT 的表达显著高于 CD8+αβ T 细胞（图 2h ）。

在典型的 αβ T 细胞中，高表达耗竭标志物伴随着低表达效应因子，这通常是其功能紊乱的显著标志，于是作者接下来探究了这些肿瘤浸润性 Vδ2-T 细胞是否降低细胞因子的分泌。于是作者首先证实了共表达 PD-1 、 TIGIT 和 TIM3 的 Vδ2− 细胞，它们约占肿瘤浸润 Vδ2− 细胞的 8% （图 2i ），作者将这群细胞命名为 PTT+ （图 3a ）。有趣的是，相比较于非耗竭性 T 细胞， PTT+ 细胞低表达 IL-2 ，但 IFNγ, TNF 和 PRF 的水平却没有发生显著变化（图 3b-3c ）。此外， PTT+ 细胞中 CTLA-4 、 Ki67 、 4-1BB 和 CD39 的表达水平显著升高，这些蛋白都是抗原刺激过的效应细胞通常会表达的蛋白（图 3b ）。为了验证其细胞毒作用，作者将 PTT+ 细胞与 RCC 肿瘤细胞共培养，并将 αβ CD8+T IL 细胞也与 RCC 共培养作为对照，结果显示， PTT+ 细胞与 αβ CD8+TIL 细胞对自体肿瘤的杀伤能力旗鼓相当（图 3d ）。且这种细胞毒作用在给予抗 PD-1 抗体后并未增强（图 3e-3f ）。

这些结果表明，这些耗竭性 PTT+ 细胞同时具备肿瘤杀伤能力。

图 3

3. 耗竭性 Vδ2 ⁻ 细胞维持其效应分子的表达

为了进一步剖析 γδ T 细胞的功能状态，作者对 6 例人 RCC 肿瘤的 γδ T 细胞进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) ，并使用 Scanpy 对结果进行分析。经过标准质量控制和预处理后，使用 Leiden 算法对细胞进行聚类，得到 8 个独立的 γδ 子集 ( 图 4a) 。通过 Vδ 基因的表达对 Vδ2 和 Vδ2− 细胞进行鉴定（图 4b ）。单细胞测序结果显示，其主要富集为 Vδ2+(2 和 4) 或 Vδ2− 细胞 (1 、 3 、 7 和 8) 的簇以及杂交簇 (5 和 6) （图 4c ），这支持了这两个 γδ T 细胞亚群在不同状态下存在并且在功能上表现出显著差异的结果。作者验证了免疫检查点 PD-1 、 TIGIT 、 TIM-3 、 CTLA4 、 4-1BB 以及效应分子颗粒酶、穿控素在 γδ T 亚群细胞中的表达（图 4c-4d ）。 Vδ2+ 和 Vδ2 - T 细胞都表达检查点受体的 mRNA ，但 Vδ2 - 亚群检查点表达水平更高。此外， Vδ2+ 细胞是穿孔蛋白和颗粒酶 B 表达的主要贡献者，几乎是唯一的贡献者，而 Vδ2 - 细胞则表现出更高的颗粒酶 A 和颗粒酶 K 表达（图 4d ）。作者鉴定到含有不同丰度的 Vδ2− 细胞的集群 1 、 6 和 7 高表达 PDCD1 、 TIGIT 和 HAVCR2 ，他们类似于 PTT 表型，伴随着中等高水平的细胞毒素酶，以及低表达的祖细胞标志物 TCF7 （图 4e ）。作者根据耗竭性 αβ CD8+T 细胞的特征对 8 种细胞簇进行耗竭评分，结果显示 1 、 6 、 7 细胞簇的耗竭程度最显著（图 4f ），进一步印证了尽管他们能够表达效应因子，但仍属于耗竭性 T 细胞。

图 4

4. 肿瘤中 Vδ2 ⁻ 细胞的扩增与耗竭有关

接下来，作者探究了数据集中的 TCR 扩增。作者发现扩增的 γδ T 水平显著高于未扩增的 γδ T 细胞，作者将后者称为“单个细胞”。  Vδ2− 细胞与 Vδ2+ 细胞的 TCR 扩增程度相当，分别为 59% 和 65% （图 5a ）。扩增的细胞表达更高水平的耗竭基因并且同时表达效应因子（图 5b ），但扩增细胞与单个细胞的先天受体表达无显著差异，作者猜测这是由于 Vδ 链的异质性。耗竭性 Vδ2− 簇主要是 1 、 7 、 6 ，他们同时是扩增最显著的组别（图 5c ）。

图 5

5.Vδ2 ⁻ 与临床 PD-1 阻断治疗的获益相关

作者通过将 Vδ2 - γδ 细胞与剩余的 γδ T 细胞以及从同一肿瘤中分选的 CD4+ 和 CD8+αβ T 细胞进行差异表达分析，获得了肿瘤浸润的 Vδ2 - 细胞 的转录特征（图 6a ）。作者使用 Vδ2−   信号来计算数据集中的 Vδ2− 打分（图 6b ）。其中 Vδ2− 得分最高的是图 4a 中的聚类 1 、 6 和 7 ，它们都共同表达 PDCD1 、 TIGIT 和 HAVCR2 。 Vδ2− 的特征除了普遍存在的核糖体蛋白外，还包括抑制基因 (KLRD1, MATK 和 AOAH) 和效应基因 (NKG7, CRTAM 和 CCR5 配体 CCL5) ，以及 T 细胞趋化因子 (XCL1 和 XCL2) 或参与长期组织内先天效应细胞发育的基因 ( 如 CD7 或 ZNF683) （图 6c ）。为了研究肿瘤浸润的 Vδ2−γδ T 细胞是否与临床相关，作者首先将这种转录特征应用 TCGA 中 RCC 患者的癌症基因组图谱。结果显示 Vδ2− 转录组评分较高的患者的 5 年生存率明显更高 ( 图 6d) 。接下来，作者分析了来自 IMmotion150 的肾癌研究（ NCT01984242 ），通过 263 例患者的肿瘤表达数据来分析肿瘤浸润的 Vδ2−γδ T 细胞是否与 PD-1 阻断的临床反应有关。在这项试验中，转移性 RCC 患者接受舒尼替尼、阿特唑单抗 ( 抗 PD-L1) 或阿特唑单抗 + 贝伐单抗 ( 抗 VEGF) 治疗。作者的 Vδ2− 分子特征与 atezolizumab + bevacizumab 联合治疗的患者的临床反应显著相关 ( 图 6e) 。作者还观察到，与舒尼替尼相比，单独使用 atezolizumab 治疗的患者有改善反应的趋势。为了研究肿瘤浸润的 Vδ2−γδ T 细胞是否与其他疾病的 PD-1 阻断有关，作者通过 Vδ2− 基因标记探究了 IMvigor210 膀胱癌试验 NCT02108652 中 168 个样本的肿瘤表达数据。在这项试验中，局部晚期和转移性尿路上皮癌患者接受了 atezolizumab 治疗。结果显示，作者的 Vδ2− 特征与该试验中改善的临床反应相关 ( 图 6f) 。这些数据表明 γδ T 细胞，特别是 Vδ2− 细胞与 ICI 治疗的成功应答有关。

图 6

总之，本文介绍了同时表达耗竭相关免疫检查点和抗肿瘤效应分子的 Vδ2 - 细胞群，并证明了该细胞群的确保留肿瘤杀伤能力，并且其与 PD-1 治疗疗效相关。