脂肪变性诱发肝癌的机制——来自丙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的启示丨Engineering
脂肪变性诱发肝癌的机制——来自丙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的启示丨Engineering
engineering2015
《Engineering》是中国工程院院刊主刊，2015年创刊，中英文双语出版，全文开放获取，目标是建设世界一流工程科技综合性权威期刊，报道全球工程前沿，促进工程科技进步，服务社会、造福人类。
引言
丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要病因。在HCV的结构蛋白中，HCV核心蛋白具有调控基因转录、脂质代谢、细胞增殖、细胞凋亡和自噬的能力，所有这些都与HCC的发展密切相关。携带HCV核心基因的转基因小鼠表现出与慢性丙型肝炎患者的临床特征相似的年龄依赖性胰岛素抵抗、肝脂肪变性和HCC。一些饮食习惯的调整，包括限制热量和富含饱和脂肪酸（SFA）、反式脂肪酸（TFA）或胆固醇的饮食，被证明会影响HCV核心基因转基因小鼠的肝脏脂肪生成和肿瘤形成。这些饮食的改变除了调节肝纤维化过程和微环境外，还调节了肝细胞的应激和增殖，从而证实了饮食习惯与脂肪变性相关的肝癌发生之间的密切联系。日本Shinshu University School of Medicine的Naoki Tanaka等研究人员综述了HCV基因组转基因小鼠模型的研究结果，重点介绍了HCV核心基因转基因小鼠的研究结果，并讨论了HCV核心蛋白诱导脂肪变性和肝癌发生的机制，以及饮食习惯对脂肪变性所致肝癌的影响。
丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的慢性肝炎是一个严重的全球性问题，因为慢性丙型肝炎是导致肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要原因。世界卫生组织（WHO）2017年的一份报告显示，全球约有7100万人（1%）感染HCV。大约30%的HCV感染者表现为持续性慢性肝炎，这可能会发展为肝硬化和HCC。
HCV是黄病毒科中肝病毒属的一员，是一组微小的、有包膜的单链RNA病毒。HCV颗粒是由结构蛋白形成的，包括HCV核心蛋白及包膜糖蛋白E1和E2。由于非结构蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）在HCV生命周期中发挥重要作用，因此它们已成为直接作用于抗病毒药物的分子靶点。例如，NS4B调控复制复合体的形成，NS5A是HCVRNA复制和颗粒产生的主要成分，NS3~NS5B负责复制模块并催化病毒RNA基因组的扩增。HCV含有一个9.6 kb的正链RNA基因组，由一个带有内部核糖体进入位点（IRSE）的5′非编码区（NCR）、一个编码结构蛋白和非结构蛋白的开放阅读框以及一个3′ NCR组成（图1）。以前的研究表明，HCV感染与各种代谢性疾病之间存在很强的相关性，包括肝脂肪变性、2型糖尿病（T2DM）以及铁和卟啉蓄积。然而，代谢紊乱在很大程度上也受到日常生活方式的影响，如暴饮暴食、高脂肪和高碳水化合物饮食以及缺乏锻炼。此外，持续的HCV感染通常伴随肝脏炎症和纤维化，通过炎症级联和肝细胞损伤扰乱胰岛素信号和脂质代谢。因此，很难理解HCV对代谢性疾病的单一直接作用。为了破译HCV的致病原理，研究人员利用这10种结构蛋白和非结构蛋白建立了多种HCV转基因小鼠模型。事实上，只有HCV核心蛋白转基因小鼠表现出与HCV感染患者相似的自发性葡萄糖耐受不良、肝脂肪变性和HCC，这证实了HCV核心蛋白在HCV相关代谢紊乱中的关键作用。
图1. 丙型肝炎病毒（HCV）及其核心蛋白的结构。HCV基因组（结构基因和非结构基因）编码了一个9.6 kb的多聚蛋白，其两端各有5’和3’非翻译区域（UTR），该多聚蛋白由细胞和病毒蛋白酶加工成10种结构蛋白和非结构蛋白（核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。核心蛋白由信号肽酶（SP）从多聚蛋白中释放出来。191个氨基酸的前体核心经信号肽酶（signal peptide peptide ase, SPP）处理，得到一个约177个氨基酸的成熟蛋白，它由两个结构域（D1和D2）组成。D1域被划分为基本域1（BD1）、基本域2（BD2）和基本域3（BD3）。D2结构域包括螺旋I（HI）和螺旋II（HII），它们被一个疏水环（HL）隔开。图片引用经Springer Science Business Media New York © 2014和Elsevier © 2011许可。
日本Shinshu University School of Medicine的Naoki Tanaka等研究人员综述了近年来HCV基因组转基因小鼠模型的研究进展，重点介绍了HCV核心基因转基因小鼠的特征观察，并探论了HCV核心蛋白诱导脂肪肝细胞癌发生的机制 。为了进行客观全面的综述，他们在PubMed中输入了几个关键词（HCV转基因小鼠、脂肪肝、HCC、脂肪酸、胆固醇、热量限制、饮食干预等），搜索1995—2021年发表的相关文章。
为了获得HCV核心基因转基因小鼠，含有乙肝病毒调控元件的表达载体pBEP Bgl II被用于实验中的质粒构建过程。经 P st I和 Eco RI双酶切，并经T4 DNA聚合酶处理和 Bcl I连接后，从质粒pSR39中切下含有核心蛋白编码区的(1±6) kb的片段。随后，将其连接到质粒 p BEP Bgl II 的 Bgl II位点上。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化pBEP39的(1±2) kb Kpn I- Hin dIII片段，并将其微注射到C57BL/6N小鼠胚胎中。然后通过聚合酶链反应（PCR）扩增1 ng尾部DNA以鉴定转基因小鼠（图2）。这种转基因小鼠的核心蛋白水平与感染HCV的人类相似。小鼠在出生后3个月开始在肝细胞中出现LD，肝脏脂肪变性随着动物的生长而持续。细胞质中含有脂滴的肝腺瘤大约在小鼠16个月大时出现，小鼠在17个月大时最终表现为肝癌（HCC）。
图2. 丙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠构建。pBEP39是一个包含乙肝病毒调控元件的表达载体。将(1±2) kb Kpn I- Hin dⅢ片段显微注射到小鼠胚胎中，然后将小鼠胚胎导入C57BL/6N 小鼠。P：启动子；(A)n：多聚腺苷化信号。图片引用经Elsevier © 2011和Society for General Microbiology © 1997许可。
通过部分复制HCV感染患者的表型并揭示HCV蛋白在体内的直接致病性，产生表达HCV蛋白的转基因小鼠的技术已经在肝病学和病毒学领域开辟了新的大门。只有HCV核心基因转基因小鼠表现出肝脏胰岛素抵抗、肝脂肪变性和HCC，因此其可作为确定脂肪变性相关肝癌发生中的分子事件的良好模型。该小鼠品系说明了代谢方法在肝脏疾病病理分析中的重要性。此外，使用HCV核心基因转基因小鼠进行的序贯研究揭示了饮食干预对脂肪变性源性HCC的影响，这可能适用于人类 NAFLD 相关的HCC。HCV核心基因转基因小鼠将有助于针对脂肪变性衍生的肝癌预防药物的发现。这种有价值的动物模型跨越了病毒学、肝病学、代谢和营养学的交叉领域，并强调了新的工程发展给医学研究带来创新发现的重要性。
关键词： 脂肪变性；肝细胞癌；反式脂肪酸；饱和脂肪酸；饮食限制；丙型肝炎病毒核心蛋白
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原文链接：http://www.engineering.org.cn/en/10.1016/j.eng.2021.08.019
以上内容来自： Pan Diao, Fangping Jia, Xiaojing Wang, Xiao Hu, Takefumi Kimura, Takero Nakajima, Toshifumi Aoyama, Kyoji Moriya, Kazuhiko Koike, Naoki Tanaka. Mechanisms of Steatosis-Derived Hepatocarcinogenesis: Lessons from HCV Core Gene Transgenic Mice [J]. Engineering, 2021, 7(12): 1797-1805.
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