今天分享的是发表在
Science Translational
Medicine
上题为“
Integrating spatial and single-cell transcriptomics to characterize the
molecular and cellular architecture of the ischemic mouse brain
”
的研究性论文，该研究利用空间转录组和单细胞转录组测序技术对缺血性卒中模型小鼠大脑的基因表达和细胞互作特征进行了深入解析，并通过细胞外囊泡介导实验验证
卒中
后
LGALS9-CD44
通路促进大脑修复的重要作用，为卒中有效治疗手段的开发提供了新的靶点。
研究背景
缺血性脑卒中与小胶质细胞中一些对于神经炎症有反应的多个基因的表达有关，除小胶质细胞外，星形胶质细胞、少突胶质细胞和浸润免疫细胞也会由于缺血性损伤导致分子反应发生改变。因此，对全脑和细胞特异性免疫反应的研究可以使人们更好地了解这些细胞复杂的时间依赖性相互作用，这些相互作用决定了缺血性损伤后的致病结果。
对于缺血性损伤中心与周围区域细胞类型和位置特异性分子发生的变化知之甚少。因此，需要对缺血性脑组织进行空间分辨的单细胞转录组学分析。单细胞
RNA
测序（
scRNA-seq
）能够探索脑卒中后的细胞异质性，但其缺失空间信息，包括缺血核心周围异质细胞和分子标志的分布。空间转录组学可以对组织进行全面的转录组分析，同时保持测序分子的空间定位。因此，将来自正常和病变组织的单细胞和高维空间数据的正交整合可以促进缺血性损伤后细胞通讯的研究。
研究人员对出生后第
56
天（
P56
）的
C57BL/6J
小鼠通过光血栓形成（
PT
）或
sham
手术（对照组）进行局灶性皮质缺血。术后
3
天，分别从接受
PT
的小鼠的缺血脑半球和对照小鼠的同侧脑半球收集四个冠状切片进行
10x Genomics
空间转录组分析。实验共获得
19,777
组的转录组数据，使用
t-SNE
对这
19,777
个转录组图谱进行聚类和可视化。将每个
cluster
与
Allen
小鼠大脑图谱定义的解剖大脑区域对应。此外，结果显示在
PT
小鼠的大脑中存在缺血区域，包括缺血核心区（
ICA
）、缺血周围区域近端区域（
PIA_P
）和缺血周围区域远端区域（
PIA_D
），结果揭示了与缺血小鼠大脑中不同的解剖脑区相对应的独特基因图谱，表明空间转录组学是准确评估缺血性脑卒中引起脑损伤的一种有效方法。
研究人员通过对空间转录组学数据分析，以研究缺血周围区域细胞类型的空间分布，分析了
PT
组和对照组
spots
之间的差异表达基因（
DEG
），发现几乎所有其他脑区都存在
DEG
，其中在缺血区域中观察到的
DEG
高于其他脑区（图
A
、
B
）。对缺血周围区域的
DEG
结合艾伦脑图谱进行比较分析发现，在近端缺血周围区域，皮质层标志物的表达丢失，表明了
PT
卒中模型皮层重组的影响。通过评估基因表达与
ICA
距离的相关性，来揭示同侧半球整体缺血诱导基因（
IIGs
）的空间特征，研究确定了
137
个基因表达与
ICA
距离呈负相关的
IIG
（图
C
），这些
IIG
与神经炎症过程有关，例如小胶质细胞活化和突触修剪（图
D
、
E
），其中包括某些已知的免疫调节剂，例如半乳糖凝集素家族基因（
Lgals1
、
Lgals3
和
Lgals9
）、补体成分基因（
C1qa
、
C1qb
和
C1qc
）等（图
F
、
G
），这表明免疫相关基因变化在近端区域占主导地位。此外，还发现了
10
种
IIGs
的表达与与
ICA
的距离呈正相关，这些体内平衡相关基因变化在远端区域占主导地位。
在基因表达的空间动态的基础上，研究人员进一步研究了缺血周围区域细胞类型的空间分布。使用
scRNA-seq
分析，从
10
只接受
PT
的小鼠和
10
只接受假手术的小鼠的缺血周围区域生成了
9799
个单细胞转录谱，根据特定的细胞标志物将其注释为
12
种主要细胞类型。结合空间转录组和
scRNA-seq
数据确定
PIA_P
和
PIA_D
中每个点的潜在细胞类型组成，从而确定
scRNA-seq
识别的所有细胞类型的空间定位数据。结果显示小胶质细胞、巨噬细胞和单核细胞主要位于
PIA_P
，而其他细胞类型则位于
PIA_D
，表明缺血区域细胞分布的异质性。
使用
Cell chat
对单细胞数据的
12
种细胞类型进行分析，发现与对照组相比，
PT
组的细胞群的相互作用强度和总数都显著增强
,
并且在
12
种细胞类型中检测到的配体
-
受体对分为
31
种信号通路（图
C
），基于
scRNA-seq
数据和
Cell Chat
数据库对差异表达的分泌配体基因进行分析，表明由
LGALS9
驱动的半乳糖凝集素信号通路在缺血性卒中后显著增强，
Lgals9
主要由小胶质细胞和巨噬细胞表达，并作用于表达
Cd44
的星形胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞，提示
Lgals9
可能在缺血损伤中起到重要作用。因此研究人员后续使用
qPCR
及
RNA scope
均证实
Lgals9
在
PT
小鼠脑组织中表达显著升高（图
E
、
F
）。除
Lgals9
外，未包含在
Cell Chat
数据库中的
LGALS1
和
LGALS3
在脑卒中小鼠缺血周围区域中也会出现显著增加。
由于小胶质细胞和巨噬细胞
Lgals9
的主要来源，因此，研究人员首先进行了
RNA
scope
确定缺血周围区域小胶质细胞（
Tmem119
）中
Lgals9
的表达，随后使用
scRNA-seq
数据对缺血周围区域的小胶质细胞和巨噬细胞进行重新聚类分析，将两种细胞进一步分成不同的亚型。在小胶质细胞的五种亚型中，在接受
PT
的小鼠大脑缺血周围区域主要为表达典型的小胶质细胞激活标记物
(Tspo)
以及干扰素反应标记物
(Ifi27l2a
和
Ifitm3)
的
MG3(51.68%)
、
MG4(22.25%)
和
MG5(20.22%)
亚型。结合空间转录组学和
sc RNA-seq
数据，分析这三种缺血诱导的小胶质细胞亚型的空间分布，发现
MG3
和
MG5
细胞倾向于位于
PIA_D
，而
MG4
细胞倾向于位于
PIA_P
。同时将巨噬细胞也划分为四种亚型，并且所有巨噬细胞亚型都主要位于
PIA_P
，而
Lgals9
在
intMo Mac
和
Arg1 Mac
亚型中的表达高于
MHCII Mac
和
che Mac
。通过揭示不同的空间亚型群体和亚型特异性基因表达模式，说明了缺血性卒中后组织中的小胶质细胞异质性和多重巨噬细胞浸润。
为了研究
LGALS9
对
PT
小鼠功能恢复的影响，研究人员构建了将
LGALS9
靶向递送至小鼠脑部脑的细胞外囊泡（
EV
）。使用该方法来测试
LGALS9
靶向递送是否会对小鼠发生脑卒中后的感觉运动功能发挥作用。在
PT
后第
3
天进行磁共振成像（
MRI
），统计不同处理下小鼠脑梗死区域面积，发现
RVG-LGALS9-EVs
组小鼠与
RVG-Vector-EVs
组小鼠的脑梗死区域面积差别不大，但网格行走试验中足部故障次数显著减少，另外，
RVG-LGALS9-EVs
组小鼠在粘合剂去除测试和气缸测试中表现均比空载体组组小鼠表现优异，但敲低
Cd44
后逆转了以上结果。实验结果表明
LGALS9-CD44
通路在促进卒中后脑修复中可能起重要作用。
总结
研究人员首先对缺血性脑卒中模型小鼠大脑进行空间转录组分析，识别梗死周围区特异性基因集群。进一步对梗死周围区脑组织进行单细胞转录组测序，并与空间转录组进行整合分析，明确了异质性细胞的空间和互作特征。此外，研究团队发现，
GALECTIN
信号通路在卒中后显著增强。通过构建脑靶向的细胞外囊泡并将
LGALS9
递送至脑部，可以有效促进卒中模型小鼠的脑修复。本研究不但建立了缺血性卒中模型小鼠大脑的空间和单细胞转录图谱，并发现
LGALS9-CD44
通路在促进卒中后脑修复中的重要作用，为卒中有效治疗手段的开发提供了新的靶点。研究结果强调了整合单细胞和空间转录组学来表征疾病状态的细胞变化和确定潜在治疗靶点的效用。
