科研| Nat Microbiol：普通拟杆菌的蛋白酶与溃疡性结肠炎疾病严重程度相关

1实验设计

    我们收集了来自单一学术性   IBD 中心 （加利福尼亚大学圣地亚哥分校）的便利生物库的患者样本，这些样本利用多组学方法通过临床疾病活动指数和内窥镜、组织学严重程度的盲法评估进行了广泛的表型分析 （补充表 1）。我们的结果数据代表了迄今为止关于 IBD 患者最广泛的多组学资源之一，利用患者匹配的血清和粪便样本进行宏基因组和 16S rRNA 基因扩增子测序、代谢组学、宏肽组学、血清蛋白质组学和宏蛋白质组学分析（扩展 数据图 1） 。 收集初始 研究小 组 40份UC 患者的 血清和粪便样本，随后收集了 第二 组 210份粪便样本，其中包括 73 例 U C 患者， 117 份 C D 患者 （ CD；大致分为回肠、回结肠和结肠亚型） 和 20 名 肠炎的 志愿者。我们先前建立的共享数据库 经过 组装和量化 后 综合宏基因组 -宏蛋白质组学 的 方法用于微生物基因和蛋白质之间的直接比较 。 与传统的无标记 宏 蛋白质组学方法相比，我们的多重 化宏 蛋白质组学方法的应用提供了每个样本更多的蛋白质鉴定和超过 10 倍的量化的蛋白质。我们通过与从人类微生物组计划的 IBD 多组学数据库下载的数据进行比较来证明这一重要的技术优势，人类微生物组计划的 IBD 多组学数据库明显 小于 本研究队列 的 患者群体 （ 扩展数据 图 2）。

2   IBD 严重程度的 多 组学 相关性

尽管我们的队列代表了不同的患者群体（补充 表 1），但许多临床严重程度指标显示出高度相关性 （图 1 a ）。鉴于严重程度指标的重叠，一个代表性指标包括患者症状、 UC 的 Mayo 评分 ，以及来自 CD 患者 的克罗恩病活动指数 (CDAI) 的报告结果（大便频率、腹痛、总体健康状况）被选中。在收集的所有 多 组学中，疾病严重程度与 α多样性和β多样性均显着相关（ 图 1b,c，补充表2和 图 1a-f）。CD 亚型和两个单独处理的 UC 队列显示出与健康对照组不同的独特微生物群组成（ 图 2 a 和补充 图 2）。我们观察到基于粪便的组学数据分布之间的相关性比血清蛋白质组 数据 更强（ 图 2b和补充 图 1g , h），并且 宏 蛋白质组 能 最强 预测 UC活性，紧随其后的是组合数据和代谢组（ 图 2c 和补充表 3）。与UC不同，CD  患者微生物组的一个有影响力的特征是肠杆菌科成员 占 优势 （扩展数据图 3 ）。在患有活动性 UC的患者中，我们还观察到人类蛋白质的增加，以及与活性相关的磷酸胆碱等代谢物类别（ 图 2d,e) 。

图 2 IBD 疾病活动的多组学分析 。 a，按疾病活动状态划分的16S 细菌 门 类 组成。患者样本组的平均门组成以条形 图 显示。条形 图 表示 UC 队列 1的样本大小为 n = 18、12、10；UC 队列2的 n = 34、9、13 ； 结肠 CD n = 19, 8, 1； 回 结肠 CD n = 22, 7, 3 ；回 肠 CD n = 19, 4 ， 2（分别为低、中和高活性）；n = 15个健康对照样本 。 b, 数据类型相关性。数据类型之间的 Pearson 相关性显示在热 图 中 。 Bray-Curtis 距离度量用于所有数据类型，并且使用 Mantel 检验在距离矩阵上 计算 相关性 。 c，评估预测 UC 疾病 活动 的 多 组学 数据。对每个 UC队列进行n = 100次随机森林分析迭代的均方误差 训练分析预测部分 Mayo疾病活动指数（从0-9）， 显示 在 从最强预测能力（ 宏 蛋白质组 ）到最小预测能力排序 （血清蛋白质组） 的箱线 图 。箱线 图 由中位数、四分位数和 1.5× 四分位数范围定义 。 d，疾病活动状态的元蛋白质组组成。人类和微生物蛋白质的相对丰度按疾病活动状态进行平均，并按不同的患者类别绘制。条形 图 表示 UC 队列 1的样本大小为 n = 18、12、10；UC队列2 样本 n = 38、11、14；CD，n = 66、 31、9（分别为低、中和高活性）。e ，与   UC 疾病活动相关的顶级代谢物类别。对化学类别求和的代谢物丰度进行平均，并对疾病活动进行线性 回 归。前 10个正（上）和负（下）相关的化学物质类别的 r 值按诊断和队列绘制，并按来自 UC队列的总 r 值的顺序显示。

利用微生物群基因和蛋白质的直接比较 , 线性回归确定了与临床疾病严重程度最相关的特征 ( r   > 0.3)。比较正负关联的属注释确定拟杆菌属蛋白质占与 UC 疾病活动 正相关的蛋白质的 40-60% （图 3a 和扩展数据 图 4）。疾病活动与拟杆菌属之间的这种关联在两个UC队列中得到证实，并被确定为UC所特有的，因为CD亚型各自呈现疾病相关蛋白的独特特征（扩展数据 图 5）。宏基因组在很大程度上反映了宏蛋白质组中确定的关联的属水平偏差的方向和幅度；然而，与 宏 蛋白质组相比，拟杆菌属基因与 UC中高疾病严重程度的关系较弱（ 图 3b 和扩展数据 图 4）。对与疾病活动相关的拟杆菌属蛋白质的功能分析显示酶家族的 表达 增加，更具体地说，蛋白酶（ 图 3c） 。 B. vulgatus 和 B. dorei ，两种密切相关的物种，在健康成年人中普遍存在 ， 在 UC 患者的宏基因组拟杆菌属 中约占 40% （ 图 3d）。我们接下来分析了源自59种拟杆菌的119种不同酶和蛋白酶与 UC 严重程度的相关性。丝氨酸蛋白酶，包括 6 种 二肽酶，是 常见 的拟杆菌属 中与   UC 活性相关的蛋白酶之一（ 图 3e）。应用异常值方法比较宏基因组和宏蛋白质组数据，我们确定了 B. vulgatus   和 B. dorei 蛋白酶 产量过多或不足的患者样本 ，并且观察到与蛋白酶减少组和典型的 UC 患者相比，蛋白酶增多的患者具有更高的临床严重程度和内窥镜活性（图 3f 和扩展数据 图 6a ）。 从组织学角度来看，仅 18.8% 患者 归类为 “过度” 生产者 处于组织学缓解状态，而 38.5% 归类 为 “生产不足”的患者和   45% 的所有其他患者处于组织学缓解状态 （扩展数据图   6b）。由于一些相关的蛋白酶包括丝氨酸和金属蛋白酶 （ 主要在细胞外空间发挥作用的蛋白酶类 ）， 我们假设这些蛋白质可能在细胞外蛋白水解和疾病活动的恶化中发挥作用。  

图 3 综合宏基因组 -宏蛋白质组学分析揭示了拟杆菌属蛋白酶区分 一类 活动性 UC患者 。 a，与疾病活动相关的蛋白质分类偏差。对每种量化的蛋白质进行针对疾病活动的线性 回 归，并按患者队列绘制所有高度相关蛋白质的分类起源（ Pearson 值 r > 0.3 或 r < -0.3） 。 b， 在 MG 或 MP 水平上高度相关的微生物开放阅读框的分类起源 的 偏差比较。线性 回 归如在 a中进行，正相关 (r > 0.3) 和负相关 (r < -0.3) 中分类群的百分比表示通过 log ₁₀ 转换绘制。 c, 在活动性   IBD 期间的拟杆菌中 的功 能转变。将来 自 a的与疾病活动相关的拟杆菌属蛋白质 (r > 0.3) 与其余已鉴定的拟杆菌属蛋白质进行比较 ， 以确定与 UC疾病活动相关的 假 定功能变化 。 d ， UC 患者MG中拟杆菌属的物种水平调查。拟杆菌属物种组成 图 显示了 UC疾病活动类别，以及每个队列中的平均值。每个组成 图 上方是点 图 ，表示 MG 中的拟杆菌属读数的平均丰度，或显示 UC 队列中一般分布的核密度估计的小提琴 图 。数据是根据 UC 队列 1 样本 n = 18, 12, 10 和UC队列2样本n = 38, 13, 13 的样本大小编制的（每个分别排序低、中和高活动）。e，拟杆菌属蛋白酶和酶 类 与 UC疾病活动的相关性 。 在热 图 中比较了在不同拟杆菌属物种中鉴定的蛋白酶的物种水平注释，显示了每种酶与每个 样本 的 UC活性的相关性。f，拟杆菌属蛋白酶过度产生的患者与疾病活动增加相关。采用异常值方法将 B. vulgatus 和 B. dorei 宏基因组丰度与来自 B. vulgatus 和 B. dorei 蛋白酶的总蛋白质丰度进行比较，以确定具有高于或低于宏基因组预期蛋白酶存在的 UC患者组。袋状 图显示有一条最佳拟合线和生产过剩或生产不足状态由最佳拟合线上方或下方的异常状态确定。过度生产者、生产不足者和其他 UC患者的疾病活动分别绘制在箱线 图 上。 双 侧 t 检验 P 值 显示在箱线 图 上方。样本量包括 n =16、14和77，分别代表过度生产者、生产不足者和其他人。箱线 图 由中位数、四分位数和 1.5 × 四分位数 范围定义。

3分析 UC患者组学和拟杆菌属上清液中的蛋白 水解

代谢组学和 元 肽组学分析证实了蛋白水解在 UC 患者中的重要性 。 最初是通过将二肽鉴定为与 UC 疾病活动具有 第二 相关性的代谢物类别来观察 发现的 （ 图 2h 和4a）。二肽和寡肽是与疾病活动呈正相关 （ r > 0.3）的代谢物中最常见的两个化学 物 类别，分别占总正相关的 44% 和 5.8%。为了进一步分析寡肽，采用从头测序方法来分析元肽组（来自复杂的多物种样品的肽）。结果在重 度 UC 患者 粪便样本和拟杆菌蛋白酶过度产生的患者中发现了更多的肽片段（ 图 4b 和扩展数据 图 7）。数据还 确认了 来自人类蛋白质的肽片段，包括来自胶原蛋白和粘蛋白的结构蛋白（ 图 4c）。这些蛋白质代表了 UC 中蛋白酶的潜在靶标。中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶 - 3 的已知切割模式在 已知 肽的末端之间 不属于 强信 号（扩展数据图 7b），表明中性粒细胞蛋白酶可能不是患者蛋白水解的主要 来源 。与来自 UC 患者粪便和血清的疾病活动相关的 t 宿主蛋白的网络分析强调了蛋白水解的调节是一种常见功能（补 充图 3）。

为了表征存在于我们确定为与   UC 疾病活动相关的拟杆菌属物种中的蛋白酶活性，通过蛋白质组学和蛋白酶活性测定分析细菌培养物 的 上清液。抑制丝氨酸蛋白酶是破坏 B. vulgatu s 上清液蛋白质水解的最有效方法 （图 4d）。蛋白质组学分析发现丝氨酸型活性是 B. vulgatus 、 B. dorei 和 B. thetaiotaomicron（B. theta） 上清液蛋白质中最常见的酶功能类别（补充 图 4a）。接下来通过与 B.theta 相比 ，   B. vulgatus 的上清液中增加的丰度对鉴定的蛋白酶进行排序（补充 图 4b），然后通过 UC 群组中的总相关值进行排序（ 图 4e）。此外，比较了与UC患者相关的拟杆菌属蛋白酶的特性和在拟杆菌属上清液中发现的那些 蛋白酶 （补充 图 4c和 表 4）。  

图 4评测 UC患者和拟杆菌属上清液中的蛋白水解。   a，二肽的丰度随着疾病活动的增加而增加。标注为二肽的代谢组学特征的每个样本平均相对丰度是根据疾病活动度绘制的，每个患者队列显示线性 回 归最佳拟合线和 95%置信区间。 b， 在活动性 UC期间肽片段更 丰富。通过从头肽组学工作流程鉴定的肽数量与 UC疾病活动 指数 绘制 相关图， UC 队列1显示了具有95%置信区间的线性 回 归最佳拟合线。 c，来自人类蛋白质的肽片段的数量表明UC蛋白水解的潜在目标。最常从粪便样本中的短肽中鉴定出的人类蛋白质的基因符号显示在 y 轴上，肽的数量显示在log ₁₀ -转换后的x轴。蛋白质由观察到的蛋白质的常见类别着色。d， B. vulgatus 上清液中的蛋白酶活性类别。在存在不同种类的蛋白酶抑制剂的情况下，对来自 B. vulgatus 过夜培养物的浓缩上清液进行蛋白酶活性测定。载体对照用于确定每种抑制剂的抑制百分比和平均值 ±sem ， 每个条件从 n = 11 孔中显示 n = 3个独立实验。蛋白酶抑制剂包括10 mM AEBSF（丝氨酸）、100 μM E-64（半胱氨酸）、2.5 mM GM6001 （ Metallo）和 180 μM Pepstatin A（天冬氨酰）。e， B. vulgatus 蛋白酶通过与 UC疾病活动相关性的总和排名。将UC疾病活动与 B. vulgatus 和 B. dorei 蛋白酶之间的相关值 (r) 相加 ， 显示了排名前 10 位的蛋白酶的总和 ， 每个条形的颜色代表蛋白酶类别。

4   蛋白酶抑制可在体外和体内防止   B. vulgatus   诱导的结肠上皮损伤

肠道单层的共聚焦显微镜显示 B. vulgatus 处理的上皮细胞有 显 著 影响，紧密连接蛋白、 Zo-1 和 Occludin 有明显改变（ 图 5d 和补充 图 5）。成像研究还证明了对用 B. vulgatus 处理的 Caco-2 细胞的细胞形态和肌动蛋白网络的潜在影响（补充 图 5）。对单层细胞形状的分析显示出显着的 细胞圆形度的降低（ P = 0.0043） ，这可以通过蛋白酶抑制来恢复（图 5 e ）。

为了研究 B. vulgatus 蛋白酶在体内的作用，我们在 IL10 ^−/− 无菌小鼠模型中用 B. vulgatus 进行了单菌定殖 ，将一般老鼠的饮用水用我们选择的蛋白酶抑制剂混合物补充（图 5 f ）。定 殖 10周后蛋白酶抑制对结肠上皮细胞具有保护作用，减少隐窝的炎症细胞浸润（图 5g）。蛋白酶抑制剂治疗显着改善了组织学结肠炎的严重程度（调整P 值 = 0.0061， 图 5h)， 伴随 着 B. vulgatus 引起的隐窝增生显着减少（调整 P 值 = 0.0028， 图 5i）。宏观特征，例如小鼠的结肠长度，没有显着差异（补充 图 6a-h）。进一步， 肠系膜淋巴结的免疫细胞谱显示 CD4 ⁺ 、 Th1、Th17 和 Treg 细胞群之间没有显着差异（补充 图 6i- l 和 图 7）。在这项研究中，我们无法评估蛋白酶处理在多大程度上反映了与非蛋白水解拟杆菌定殖的小鼠相似的状态，因为该对照组不包括在内。

5   UC 患者粪便中存在的 B. vulgatus 蛋白酶在移植到无菌小鼠后会导致结肠炎的严重程度

接下来我们评估在 UC 患者中 高水平的 B. vulgatus 蛋白酶对肠道炎症发展的影响程 。为此，我们将 UC 患者的粪便移植到易患结肠炎的 IL10 缺陷的无菌小鼠中（ 图 5j）。我们选择了 2组 是否含有 高水平 B. vulgatus   蛋白酶的患者粪便样本（每 组 3 名 UC 患者） ， 用于移植到易患结肠炎 IL10 缺陷的无菌小鼠 中。这些小鼠中有一半通过饮用水给予蛋白酶抑制剂混合物（每种 组 9 只小鼠）。根据疾病的两个总体指标（结肠缩短和脾肿大 情况 ，图 5k,l ） 和组织病理学分析（ 图 5m），给予富含蛋白酶的粪便样本的小鼠表现出明显的结肠炎。这些表型在接受缺乏大量 B. vulgatus   蛋白酶的 UC 患者粪便的小鼠中并不明显。在其他器官上未观察到显着差异（扩展数据 图 9a-f）。蛋白酶抑制剂混合物 在 给予低 蛋白酶粪便样本的小鼠 中 这些参数没有显 著 影响，但显 著 减轻了接受富含蛋白酶的粪便样本的小鼠表现出的结肠炎。通过测量粪便载脂蛋白丰度和脾脏细菌负荷来评估结肠炎症显示出相似的 程度 ，但未达到统计学意义（扩展数据图 9g，h）。这些研究表明，拟杆菌属蛋白酶增加的 UC 患者的微生物群具有较高的致结肠潜在性，并表明蛋白酶抑制可作为严重UC的治疗干预 方式 。

最后，为了确认粪便移植研究中存在 B. vulgatus 蛋白酶，对小鼠粪便进行了宏蛋白质组学分析。将移植 一名富含 B. vulgatus   蛋白酶 患者样本的 小鼠的粪便与 移植了 一名低蛋白酶对照患者 样本的小鼠粪便 进行比较，无论是否存在蛋白酶抑制剂混合物 ， 我们 都 能 从 移植富含蛋白酶患者样本的小鼠中 检测到 升高的 拟杆菌属蛋白质和 B. vulgatus 蛋白酶，（扩展数据 图 9i 和 图 5n）。在这些小鼠中从 B. vulgatus   鉴定 出来 的蛋白酶的共同功能包括丝氨酸型肽酶活性和二肽酶活性（扩展数据 图 9j）。为了指导未来对 B. vulgatus 蛋白酶的研究， 对 UC患者中 含 有 蛋白酶的特性、 以及蛋白酶 体外研究和体内研究之间进行了比较（扩展数据 图 9k、1 和补充 表 4）。值得注意的是，在整个研究过程中一致地鉴定了几种二肽酶（例如， DPPIV、DPPVII）。这些肽酶在营养受限区 域的氨基酸代谢 和牙龈卟啉单胞菌 （ 一种与牙周病有关的细菌 ） 的毒力 中发挥 作用。有趣的是，人类 DPPIV 是众多 用于治疗糖尿病 疗法的 目标。 DPPIV 抑制剂还显示在结肠炎模型中具有保护作用（归因于 能抑制 胰高血糖素样肽 - 2降解），因此我们推测 B. vulgatus   DPPIV可能作为潜在的治疗靶点 。

图 5 抑制 蛋白酶 活性 在体外和体内保护免受 B. vulgatus 和粪便移植诱导的病理损伤。 a， 使用 Caco-2 细胞单层和拟杆菌属 相互作用 的体外研究的示意 图 。 b，蛋白酶 被 抑制 后 显 著 恢复 与 B. vulgatus 共培养 的 Caco-2上皮屏障 功能 。绘制了 TEER 随 时间 的变化图（ 平均值 ± s.e.m ） 。 c，蛋白酶抑制剂混合物在Caco-2与 B. vulgatus 共培养期间不会 显 著 影响 c.f.u.s的数量 ， 每个独立的实验 显示的结果 是平均 c.f.u.s ± s.e.m 。 Tw o-way ANOVA 调整了在14小时（ P = 0.69）和38小时（ P   = 0.97） 的数据并 进行 多重比较。来自 b和c的数据 是 重复 3 次 的 独立实验，其中包含 每个条件 3个 生物 重复 。 d，来自transwel l 实验的共聚焦显微镜的代表性 图 像 ， 显示了未经处理的 B. vulgatus 和 B. vulgatus   + 蛋白酶抑制剂 (PI) 鸡尾酒 组合 的代表性 图 像 ，显示 紧密连接蛋白、 Zo-1 和 Occludin 以及 DAPI 的免疫荧光。每个 图 像的下方和右侧是 XZ 和YZ切片。比例尺，20 μm 。 e，来自面板d的 图 像中细胞圆形度的量化。双 侧   t检验 P 值显示在组之间 统计， 统计数据来自 n = 151（未处理）、221 （ B. vulgatus   - PI）和 198   ( B. vulgatus   + PI) 超过 1 次 独立实验 的 细胞。箱线 图 由中位数、四分位数和 1.5 × 四分位数范围定义 。 f，单克隆IL10 ^−/− 小鼠研究的实验设计 。 给小鼠接种 B. vulgatus ， 在 10 周的定植期间，通过 给接种 B. vulgatus   小鼠的饮用水连续 添加   PI 鸡尾酒 抑制剂 。 g ，单一移植菌群 小鼠的代表性 H&E染色结肠切片。h，来自单克隆小鼠组织学评估的结肠炎评分。组间双 侧 t检验 P   = 0.0061 。 i，单克隆小鼠的隐窝长度。组间双 侧 t检验 P   = 0.0028 。 h 和 i中的数据显示为条形 图 ，平均值 ± s.d。 实验数据来自 n = 6动物 的 B. vulgatus   – PI 组 和 n = 8 的 B. vulgatus + PI 组，在 两个 独立实验中进行 。 j，人源化IL10 ^−/− 小鼠研究的实验设计。每组总共 9只动物（除了8只小鼠用于高蛋白酶+ PI 组）代表每组3个UC患者样本在2个独立实验中进行了检 测 。   k–m ， 蛋白酶抑制可改善由 UC粪便引起的结肠炎。条形 图 显示 为 平均值 ± s.d.，针对结肠长度 (P = 2.6×10 ⁻⁷ ) (k)、脾重 (P = 3.3×10 ⁻⁵ ）（ l）和结肠切片的组织病理学评分（P = 3.3×10 ⁻⁵ ）（ m） on e-way ANOVA 的叠加 P 值分析。 n ， 人源化小鼠粪便宏蛋白质组中蛋白酶的物种表征。对一组富含拟杆菌属蛋白酶的人源化小鼠和一组没有丰富蛋白酶的人源化小鼠的粪便样本进行基于 LC-MS ³ 的宏蛋白质组学分析。基于每种蛋白酶的物种注释显示了鉴定的蛋白 酶的相对丰度。

此研究中 我们有效地收集   IBD 患者的广泛 的多 组学特征并将其转化为具有生物学和治疗价值的 猜想 。除了体外和体内验证外，通过整合粪便宏蛋白质组学、代谢组学、 16S 基因扩增子测序、鸟枪宏基因组测序、宏肽组学和血清蛋白质组学，我们证明了微生物组的某些成员，例如 B. vulgatus ，可能通过蛋白酶活性 促进 UC 疾病 恶化 。此外， 基于 我们的体外和体内 的 实验 结果显示 拟杆菌属蛋白酶抑制 剂 可 作为 UC 的 潜在 治疗方法 。

为了证明我们的假设，我们利用了一些 新的 组学 方法 ，例如我们基于比较宏基因组和宏蛋白质组数据的整合方法， 以及肽片段的分析。鉴于 现有的重要的 IBD数据集包 含 了 更多缺失值方法的 蛋白质组学数据，我们有兴趣进一步研究 基于 我们 宏 蛋白质组数据 发展 而来的 独有的发现。这些数据突出的一个引人注目的观察结果是， 与 U C 疾病活动相关的约 50%的微生物蛋白是来自拟杆菌属。虽然在微生物组研究中很少收集 宏 肽组数据，但这种数据类型提供了一个重要的补充工具，用于确定源自拟杆菌属蛋白酶的蛋白水解 功能 可能与   UC 疾病 活性相关。通过整合宏基因组数据 ，为我们的发现提供了基因组背景，并确定了 用于 体外研究的拟杆菌属物种。其他组学特征（血清蛋白质组学、代谢组学和 16S） 进一步证实了拟杆菌属蛋白水解 功能 作为   UC 严重程度的一个促成因素的核心假设。

我们的研究推进了目前对 B. vulgatus 和 UC 之间联系   的了解。拟杆菌属是肠道中最丰富的物种之一，位于结肠的外粘膜层，在消化复合碳水化合物中起重要作用 。 早期研究表明 B. vulgatus 具有潜在的致病作用，因为发现该细菌 在 S PF 级 动物豚鼠中 可诱导实验性的 结肠炎。进一步加强这种联系是在   UC 患者中鉴定出针对 B. vulgatus   外膜蛋白的高水平抗体 。 然而，后来的研究确定 了 B. vulgatus 在结肠炎模型中的混合作用，最近的基因组研究只是偶尔涉及拟杆菌属。因此，对拟杆菌在 IBD中作用的详细机制尚未 完全 理解。我们的体外研究发现 B. vulgatus 和 B. dorei （它们是最近 被重新归类到 Phocaeicola 属下 的系统发育近邻 ) 破坏结肠上皮的完整性，此外，这种 功能 与丝氨酸和 /或半胱氨酸蛋白酶有关。我们 在 B. vulgatus 的 移殖菌群 动物 研 究和粪便移植研究 中 的结果 发现 来自 B. vulgatus 的丝氨酸蛋白酶在实验性结肠炎中 发挥 重要 作用 。在患者样本中，将 B. vulgatus 蛋白酶的丰度与 B. vulgatus 的宏基因组丰度进行交叉 分析 ，使我们能够识别出一 类 细菌蛋白酶水平异常高的炎症患者。有趣的是，最近的一项研究强调， B. vulgatus 蛋白酶的基因组存在以及粪便蛋白酶活性的增加与 UC的发病有关 。 总之，我们的研究将 B. vulgatus 蛋白酶与疾病的开始和疾病活动的发作联系起来。此外 ，我们的研究现在表明，抑制 B. vulgatus 蛋白酶可能具有治疗或预防作用。

虽然细胞外基质重塑 和蛋白酶活性 变化 是 IBD 中已知的 事件， 但 细菌蛋白酶在 IBD中的作用主要是 靠 推测 。 该领 域的工作主要集中在宿主蛋白酶上，例如在   IBD 患者中减少 的胰蛋白酶， 或可降解常用的治疗药物 的 基质金属蛋白酶 。一些作者估计， UC 患者中约27%的蛋白水解来自细菌蛋白酶 。当小鼠使用抗生素降低了微生物组衍生的丝氨酸蛋白酶的活性时，进一步证明了细菌蛋白酶活性在胃肠道中的重要性。这里我们能够直接识别可能导致   IBD 的细菌蛋白酶的种类和特性。鉴于目前对 UC 的治疗主要针对宿主炎症通路，我们的研究结果代表了治疗的另一种方法 。 有趣的是， 与 最有 希望 的细菌蛋白酶 类似的人体 DPPIV 酶 已经被认为是治疗开发的潜在目标 。 据我们估计，约 40%的UC患者 （可能受益于细菌蛋白酶抑制的大部分患者）可能 过度表达 B. vulgatus 丝氨酸蛋白酶 。  

蛋白酶在拟杆菌中的作用仍然是一个未充分探索的研究领域。研究表明，它们的蛋白酶可能对宿主消化酶有影响， B. vulgatus 的蛋白酶活性高于其他拟杆菌属物种 。 然而，对拟杆菌属蛋白酶作用的研究通常仅限于对来自脆弱拟杆菌的金属蛋白酶肠毒素的表征 。 在富含 蛋白酶的 拟杆菌中蛋白酶丰度的增加可能与细胞外膜囊泡有关 。有趣的是，最近的一项宏蛋白质组学研究表明，细胞外囊 泡与 IBD相关，据报道拟杆菌属蛋白是细菌细胞外蛋白的主要贡献者 。 我们假设 UC 患者 肠道中的营养可用性或宿主 -微生物相互作用可能会引发与UC活性相关的 B. vulgatus 蛋白酶的产生增加（扩展数据 图 10）。这些蛋白酶中的一种或其组合似乎能够破坏结肠上皮，这可能允许先天免疫细胞（例如中性粒细胞）流入，从而进一步加剧结肠炎。另一种假设是 B. vulgatus 携带独特蛋白酶，尽管我们认为这不太可能，因为我们的体外和体内研究使用的是从健康粪便中分离的 B. vulgatus 菌株 。

我们的研究中存在几个局限性。一个限制是我们在实验中使用了非特异性蛋白酶抑制剂，因此无法区分对我们的表型最重要的特定蛋白酶或蛋白酶类。其次，我们的单独移殖菌群研究不包括额外的对照组来比较蛋白酶抑制治疗后反映健康表型的程度。最后，我们在结肠上皮屏障上使用 B. vulgatus 上清液的实验并没有破坏在共培养中 的膜完整性，强调需要更多的工作来确定我们观察到的表型的条件和机制。

这里显示的多维度多组学整合不仅是未来   IBD 多组学研究的 重要资源，而且还作为一个例子展示了利用多组学数据整合进行 验证猜想 的发展。从对数百名   IBD 患者的广泛分析开始，并根据感兴趣的观察进一步完善我们的分析，从而在每个数据 库 为我们的假设提供了 综合 证据。我们通过大量体外和体内研究进一步缩小并验证了我们的主要假设，这些研究证明了蛋白酶 功能 抑制对预防 B. vulgatus 诱导的结肠炎的功效。总的来说，我们的研究突出了 研究 拟杆菌蛋白水解作用 的重要性， 并证明了来自 B. vulgatus 的蛋白水解 功能 可能与 UC 病理学和治疗有关。