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建议收藏丨最全分子量和分子量分布的测定方法

时间：2023-12-24 来源：浏览：

建议收藏丨最全分子量和分子量分布的测定方法

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测定不同的平均分子量和分子量分布可以采用不同的实验方法，这些方法是利用稀溶液的性质，并且常常需要在若干浓度下测定，从而求取外推到浓度为零时的极限值，以便计算分子量。有些方法是绝对法，可以独立地测定分子量；有些方法是相对法，需要其他方法配合才能得到真正的分子量。

不同的方法适合测定的分子量范围也不完全相同，下表汇总了常用的分子量测定方法，表中A ₂ 是一个描述溶液的热力学性质的参数，称为第二维利系数。

数均分子量可以用端基分析法(end group analysis)直接测定，但是由于端基密度随着分子量的增大而降低，此法可测定的分子量上限不高。蒸气压渗透法(vaporpressure osmometry, VPO)，冰点降低法(cryoscopy)，沸点升高法(ebulliometry)以及渗透压法(osmometry)的原理都是基于稀溶液的依数性质，是绝对法，得到的是数均分子量。下面，小编将介绍几种在溶液中测定分子量的方法。

渗透压法

假如有一张半透膜，膜的孔可让溶剂通过，而溶质分子由于体积大而不能通过。用这种膜把一个容器分隔成两个池。如下图，左边放纯溶剂，右边放溶液。若开始时两边液体的液面高度相等，则溶剂会通过半透膜渗透到溶液池中去，使溶液池的液面上升而溶剂池液面下降。当两边液面高度差达到某一定值时，溶剂不再进入溶液池，最后达到渗透平衡状态。渗透平衡时，两边液体的压力差称为溶液的渗透压，用Ⅱ表示，Ⅱ的单位是dyn·cm ^-2 (1 dyn.cm ^-2 =0.1 Pa)。

渗透压产生的原因是由于溶液的蒸气压降低之故，因为纯溶剂的化学位比溶液中溶剂的化学位大，两者的差值为：

式中，μ ₁ ⁰ 是纯溶剂的化学位；

μ ₁ 是溶液中溶剂的化学位；

p ₁ ⁰ 和p ₁ 分别表示它们的蒸气压。

由于溶液的蒸气压降低所导致的溶剂化学位降低，驱动着溶剂自溶剂池向溶液池中渗透。随着这种渗透过程的进行，溶液池一侧的液面将会升高，从而使半透膜两侧所受到的流体静压力产生差别。溶剂池中溶剂受到的静压力为P，溶液池中溶剂受到的静压力为(P+Ⅱ)，两者受到的静压力不同，它们的化学位也不同，其差值为：

式中V ₁ 为溶剂的偏摩尔体积，式(1-7)中的Δμ ₁ 是由于液体总压力增加而导致的溶剂化学位增加值，而式(1-6)所表示的是由于溶剂的浓度(蒸气压)降低所导致的溶剂化学位降低值。当此两者的数值相等时，溶剂在半透膜两侧的化学位相等，渗透过程达到平衡。所以：

上式可写成：

式中x ₁ 和x ₂ 分别表示溶液中溶剂与溶质的摩尔分数；n ₁ 和n ₂ 是它们的摩尔数。对于稀溶液，n ₂ 很小，上式可近似写成：

上式称为Van’t Hoff方程，式中C是溶液的浓度(g.cm ^-3 )，M是溶质的分子量。对高分子化合物而言，在一定的温度下测定已知浓度的溶液的渗透压Ⅱ，可以求出溶质的分子量M。用渗透法测定Ⅱ是测定两个液体池上的液面高度差h，根据溶剂的密度ρ和重力加速度g，可算出Ⅱ值(Ⅱ=hρg)。然而高分子溶液的Ⅱ/C与C有关，可用下式表示：

式中A ₂ 、A ₃ 分别称为第二、第三维利系数，它们表示实际溶液与理想溶液的偏差。

实验方法是：配制一系列不同浓度的溶液，测定每种溶液的渗透压，以Ⅱ/CRT对C作图(见下图7)，因为A ₃ 很小，可以忽略，故图形应为直线。直线的截距就是RT/M，斜率就是A ₂ ，因此可求得高分子的分子量。

此法测得的渗透压应该是各种不同分子量的高分子对溶液渗透压贡献的总和，所以用渗透压法测得的分子量是高分子的数均分子量。

渗透压法可测定的分子量范围有一定限度，当分子量太大时，由于溶质数目减少而使渗透压值降低，测定的相对误差增大；当分子量太小时，由于溶质分子能够穿过半透膜而使测定不可靠。在测定前，可用一系列分子量已知的窄分布的标准样品进行膜的选择。

蒸汽压渗透法

蒸气压渗透法(vapor pressure osmometry, VPO)也是测定溶质数均分子量的一种方法，这里小编对其原理作简单叙述。在一恒温密闭的容器中充有某挥发性溶剂的饱和蒸气，若在此蒸气中置一滴不挥发性溶质的溶液和一滴纯溶剂，因为溶液面上溶剂的饱和蒸气压低于纯溶剂的饱和蒸气压，于是溶剂分子就会自气相凝聚在溶液滴的表面，并放出凝聚热，从而使溶液的温度升高。而对于纯溶剂来说，其挥发速度和凝聚速度相等，温度不发生变化，那么这两个液滴之间便产生温差。当温差建立起来以后，热量将通过传导、对流、辐射等方式自溶液相散失到蒸气相。达到“定态”(并非热力学平衡态)时，测温元件所反映出的温差不再增高。

假定溶液符合理想溶液的性质，则此时溶液滴和溶剂滴之间的温差ΔT将和溶液中溶质的摩尔分数成正比。若用A代表比例系数；n ₁ 和n ₂ 分别表示溶剂和溶质的摩尔数；w ₁ 和w ₂ 分别表示两者的重量；M ₁ 和M ₂ 分别表示溶剂和溶质(高分子)的分子量，则：

上式即为蒸气压渗透法测定高分子分子量的基础，至于如何精确测定ΔT的方法很多，不在此作更多的介绍。下图是蒸气压渗透计工作原理示意图。

关于测定温度，应根据溶剂的沸点来选择。通常，测定温度愈高，达到定态的速度愈快。但是温度必须远低于溶剂的沸点。根据经验，低30~40℃较为合适。

蒸气压渗透法所测定的分子量范围依赖于温差的测定精度，一般测定上限为3×10 ⁴ ，下限则由试样的挥发性所决定，对于不挥发物质，最低可测至40。

蒸气压渗透法所测定的分子量是数均分子量。在测定数均分子量的诸方法中，除端基分析法以外，其他都是基于稀溶液的依数性质，即所测定的每一种效应都是由溶液中溶质的数目所决定的。

可以想象，如果溶质分子有缔合作用，则所测得的表观分子量将大于其真实分子量；反之，如果溶质有电离作用，则所测得的表观分子量将小于其真实分子量。而且，由于数均分子量对于质点的数目很敏感，一旦高分子试样中混有小分子杂质，则所得的表观分子量将远远低于高分子的真实分子量，这些问题必须注意。

光散射法

光散射法(light scattering)的理论非常复杂，这里小编只能作简单的介绍。光是一种电磁波，其电场和磁场的振动方向互相垂直且同垂直于光的传播方向(如下图所示)。当一束光(入射光)通过质点(原子或分子)时，因为质点的分子是由原子组成的，而原子具有原子核和外围电子，在光波的电场作用下，分子中的电子产生强迫振动，成为二次波源，向各个方向发射电磁波，这种波就称为散射光。散射光方向与入射光方向间的夹角称为散射角，用 θ 表示。发出散射光的质点称为散射中心(图中坐标的原点)。散射中心与观察点之间的距离称为观测距离，用r表示。

通常，高分子溶液的散射光强远远大于纯溶剂的散射光强。而且，散射光强还随溶质分子量和溶液浓度的增大而增大。从光学原理，光的强度Ⅰ与光的波幅A的平方成正比，即1∞A ₂ ，而波幅是可以叠加的。因此，研究散射光的强度，必须考虑散射光是否干涉。若从溶液中某一分子所发出的散射光与从另一分子所发出的散射光相互干涉，称为外干涉。若从分子中的某一部分发出的散射光与从同一分子的另一部分发出的散射光相互干涉，称为内干涉。在测量时尽量避免外干涉，即溶液配得稀一点。对于分子量小于10 ⁵ 的高分子的稀溶液，溶质的分子尺寸比入射光的波长小得多，小于λ/20，不会产生内干涉，则由分子的各部位所发出的散射光波称为不相干波。溶质的散射光强是各个质点散射光强的加和Ⅰ=∑ _i I _i ∞∑ _i A _i ² ，测到散射光强只与高分子的分子量和链段与溶剂的相互作用有关。由光的电磁波理论和涨落理论，可导出每单位体积溶液中溶质的散射光强。

式中Ⅰ、Ⅰ ₀ 分别是散射和入射光强；k是Boltzmann常数；T是温度； λ 、n、ən/ ə C、C和Ⅱ分别是光的波长、溶液的折光指数、折光指数增量、溶液的浓度和渗透压。根据渗透压公式(1-9)

将此式代入(1-12)可得：

定义单位散射体积所产生的散射光强Ⅰ与入射光强Ⅰ ₀ 之比乘以观测距离的平方为瑞利(Rayleigh)因子，用R ₀ 表示，即：

式中r ² /Ⅰ ₀ 可用已知R ₀ 值的纯溶剂(甲苯或环己烷)事先进行标定。令

当溶质、溶剂、光源的波长以及温度选定后，K是一个与溶液浓度、散射角度以及溶质的分子量无关的常数，称为光学常数，可以预先测定。这样，式(1-13)可写成：

若入射光的偏振方向垂直于测量平面，溶质分子所产生的散射光是一种球面波，散射光强度与散射角无关。当 θ =90°时，受杂散光的干扰最小，因此，常常测定90°的瑞利比R ₉₀ ，以计算溶质分子的分子量，还可得到第二维利系数A ₂ 。

实验方法是，测定一系列不同浓度的溶液的R ₉₀ ，以KC/R ₉₀ 对C作图，得直线，直线的截距是1/M，直线的斜率即是2A ₂ ，见下图。此实验中聚苯乙烯的尺寸小于 λ /20，光源为非偏振光，故纵坐标须乘以改正因子1/2。

现在考虑一下光散射法测得的分子量是什么平均值。由式(1-15)可见，当 C→0 时，

散射光的强度是由各种大小不同的分子所贡献的，所以：

与上式比较，知：

由此可见，光散射法所测得的是溶质的重均分子量。

通常光散射仪用的光源为 λ =488 nm的氩离子激光或 λ =633 nm的氦氖激光，而高分子的分子量为M=10 ⁵ ~10 ⁷ ，在良溶剂中它们的尺寸<h ₂ >1/2约为20~300 nm，远大于 λ /20，因此散射光产生内干涉。溶质的散射光强比例于叠加波幅的平方，即 Ⅰ ∞( ∑ _i A _i) ² ，结果使总的散射光强减弱，而且减弱的程度与散射角有关，测到的散射光强不仅与高分子的分子量和链段与溶剂的相互作用有关，而且与高分子链的形态有关。

飞行时间质谱

传统的质谱(mass spectrometer, MS)方法只能测定一些分子量较小的能够在离子源中被气化的化合物。为解决生物大分子和合成聚合物不能气化的问题，需采用新的质谱技术-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。该技术为生物大分子和合成聚合物的分子量和分子量分布的研究提供了良好的手段。它是将样品物质均匀地包埋在特定基质中，置于样品靶上，在脉冲式激光的作用下，受激物质吸收能量，在极短时间内气化，同时将样品分子投射到气相并得到电离。在此过程中，由于激光的加热速度极快和基质的辅助作用，避免了样品分子的热分解，从而观察到分子离子峰，而且很少有碎片离子，尤其是对合成聚合物，主要观察到的是单电荷分子离子。因此基质辅助激光解吸电离技术和飞行时间质谱结合能够精确测定聚合物样品的绝对分子量，进而得到聚合物中单体单元，端基和分子量分布等信息。

黏度法

用黏度法(viscometry)测定聚合物的分子量是借助Mark-Houwink方程：

式中[η]称为特性黏度(intrinsic viscosity)；M是分子量。在一定的分子量范围内K和a是与分子量无关的常数，只要事先知道K和a值，即可根据所测得的[ η ]值计算试样的分子量。用黏度法测定高分子的分子量时我们所感兴趣的不是液体的绝对黏度，而是溶液的黏度随着高分子在溶液中浓度的增加很快上升的 η 值。Huggins提出，溶液的黏度可以用一个像渗透压中的第二维利系数A ₂ 那样的公式来表示：

也可以写成：

式中， η 是溶液的黏度； η ₀ 是溶剂的黏度；k称为Huggins常数。式中的[ η ]为特性黏度，它是与浓度无关的数值，因此又可称为特性黏数，其量纲是浓度的倒数。美国人的浓度单位喜欢用"g/dL(g/100 cm ³ )"，而欧洲人的浓度单位喜欢用"g/cm ³ "，两者相差100倍，因此[ η ]的数值也会相差100倍，需要注意!

溶液黏度增加的分数用符号 η _sp 表示， η _sp 称为增比黏度(specific viscosity)

式中 η _r = η/ η ₀ 称为相对黏度(relative viscosity)，增比黏度和相对黏度都是无因次的量。则式（1-17b）可写成：

上式 η _sp /C 称为比浓黏度，它对C作图，得到曲线的截距就是[ η ]，斜率是k _H [ η ] ² 。

若 η _sp <1，对 η / η ₀ 取自然对数并按Taylor级数展开，即

将上式除以C并用(1-17c)式代入，可得：

此式称为Kraemer方程，式中ln η _r /C 称为比浓对数黏度。如果用比浓对数黏度ln η _r /C 对C作图，与用Huggins方程的 η _sp /C 对C作图所得的截距是一样的

只是它们的斜率不同。下图是用以上两种方程处理的结果。有关上述两个方程中的高次项在浓度很稀时可以不考虑。若这种作图呈曲线会得不到相同的截距，则需要在更低一点的浓度下测定。黏度的测量可以非常精确，而且特性黏度可以用两种作图方法来确定，这种作图方法使得它比其他表征高分子的方法精确得多得多。但是要注意温度控制要精确到±0.01℃，而且分子量不能超过10 g.mol-1，否则会在毛细管黏度计内引起剪切稀化(shear thinning)。

对于多分散性的试样，黏度法所测得的量是一种统计平均值，称为黏均分子量M _η 。因为

也可以写成：

溶液黏度的增加是由于各种不同分子量的高分子对溶液黏度贡献的总和

在求算[ η ]时需要知道的是相对黏度 η _r = η/ η ₀ 和增比黏度 η _sp =(η- η ₀ ) / η ₀ ，而不是溶剂和溶液的绝对黏度。

黏度法用于测定分子量只是一种相对的方法，必须在确定的条件下，事先订定黏度与分子量关系中的K和a值，才能计算聚合物的分子量，K和a值都可从手册中查到。下面列出了某些高分子-溶剂体系的 K 和a 值以及 a 值与高分子构象的关系。

黏度法的优点是仪器设备简单，操作便利，又有相当好的精确度。若与其他方法联合，可以研究高分子在溶液中的尺寸、形态以及高分子与溶剂分子之间的相互作用等信息。

体积排除色谱法

体积排除色谱法(size exclusion chromatography, SEC)又称为凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography, GPC)，是一种新型的液体色谱。它是用于测定聚合物分子量和分子量分布的，其核心部件是一根装有多孔性颗粒的柱子。最早被采用的颗粒是苯乙烯和二乙烯基苯共聚的交联聚苯乙烯凝胶，含有大量彼此贯穿的孔，孔的内径大小不等，近来也发展了许多其他类型的材料,如多孔硅球和多孔玻璃等。

进行实验时，以某种溶剂充满色谱柱，使之占据颗粒之间的全部空隙和颗粒内部的空洞，然后以同样溶剂配成的聚合物溶液从柱头注入，再以这种溶剂自头至尾以恒定的流速淋洗(见下图)，同时从色谱柱的尾端接收淋出液。计算淋出液的体积并测定淋出液中聚合物的浓度。自溶液试样进柱到被淋洗出来，所接收到的淋出液总体积称为该聚合物的淋出体积Ve。当仪器和实验条件都确定后，聚合物的Ve与其分子量有关，分子量愈大，其Ve愈小。若聚合物是多分散的，则可按照淋出的先后次序收集到一系列分子量从大到小的级分。

假定颗粒内部的空洞体积为V _i ，颗粒的粒间体积为V ₀ ， (V ₀ +V _i )是色谱柱内的空间。因为溶剂分子的体积很小，可以充满颗粒内的全部空间，它的淋出体积V _e =V ₀ +V _i 。

对高分子来说，情况有所不同，假如高分子的体积比空洞的尺寸大，任何空洞它都进不去，只能从颗粒的粒间流过，其淋出体积V _e =V ₀ 。假如高分子的体积很小，远远小于所有的空洞尺寸，它在柱内活动的空间与溶剂分子相同，淋出体积V _e =V ₀ +V _i 。假如高分子的体积是中等大小，而孔的形状是尺寸不等的锥体，则高分子可进入较大的孔而不能进入较小的孔，这样，它不但可以在粒间体积扩散还可以进入部分空洞体积中去，它在柱子中活动的空间增大了，因此它的淋出体积V _e 大于 V ₀ 而小于(V ₀ +V _i )。

以上说明淋出体积V _e 仅仅由高分子尺寸和颗粒的孔的尺寸决定，由此看来，高分子的分离完全是由于体积排除效应所致。如果高分子的分子量(即分子体积)不均一，当它们被溶剂带着流经色谱柱时，就逐渐地按其体积的大小进行了分离。上图是高分子在SEC仪中的分离过程示意图，下图是体积排除色谱(SEC)与小角激光光散射(low angle laser light scattering, LALLS)联机的仪器原理示意图。

为了测定聚合物的分子量，不仅需要把它按照分子量的大小分离出来，还需要测定各级分的含量和各级分的分子量。

各级分的含量就是淋出液的浓度，可以用示差折光仪、紫外吸收、红外吸收等各种检测浓度的仪器测定。各级分的分子量(分子尺寸)可用淋出体积V _e 代替，所以从SEC得到的谱图就是浓度对淋出体积的图(如上图中的曲线①)，它反映了聚合物的分子量分布。如果把谱图中的横坐标淋出体积换算成分子量M，就成了分子量分布曲线(上图中的曲线③)。如果在测定淋出液浓度的同时，测定其黏度或光散射，可直接求出其分子量，而不需要将淋出体积换成分子量了。否则，需要事先对柱子作出InM对V _e 的标定曲线。

实验证明，分子量的对数值与Ve之间存在线性关系，即：

式中A和B都是常数。

标定曲线的作法是：用一组分子量不等的单分散的试样作为标准样品(简称标样)，分别测定它们的淋出体积和分子量。以lnM对V _e 作图，见下图。由图中直线的截距和斜率求常数A和B。A、B之值与溶质、溶剂、温度、颗粒及仪器结构有关。至于Ve的单位，不需要绝对值，只要淋出体积的序数便可。

从上图可见，In M对 V _e 关系只在一段范围内呈直线。当 M> M _a 时，直线向上翘，变得与纵轴相平行。这就是说，此时淋出体积与溶质的分子量无关。实际上，这时的淋出体积就是颗粒的粒间体积V ₀ 。因为分子量比M _a 大的溶质全都不能进入孔中，而只能从粒间流过，故它们具有相同的淋出体积。这意味着此种颗粒对于分子量比M _a 大的溶质没有分离作用，M _a 称为该颗粒的渗透极限。V ₀ 值即是根据这一原理测定的。另外，当M<M _b 时，直线向下弯曲，也就是说，当溶质的分子量小于M _b 时，其淋出体积与分子量的关系变得很不敏感。说明这种溶质分子的体积已经相当小，其淋出体积已经接近(V ₀ +V _i )值。小分子物质的淋出体积可看作是(V ₀ +V _i )，由此可测V _i 值。显然，标定曲线只对分子量在Ma和Mb之间的溶质适用，故M _a ~M _b 称为颗粒的分离范围，其值决定于颗粒的孔径及其分布。

关于淋出体积的测定，想来比较简单。然而，由于试样在柱中流动时会受各种因素的影响，以至使它沿着流动方向发生扩散，即使是分子量完全均一的试样，淋出液的浓度对淋出体积的谱图中也会有一个分布，如下图所示。这一现象称为色谱柱的扩展效应，它会影响分子量分布的宽度。效应的大小与颗粒的结构、堆积密度以及仪器的构造等有关。近年来，人们对SEC仪器作了大量的改进，使扩展效应减少到最小，对测分子量分布来说，可以不予考虑。

按照体积排除分离机理，显然，用某一种高分子标样作出的标定曲线不一定适合另一种高分子。因为虽然它们在溶液中的体积相等，但分子量不一定相等。严格地说，如果要测定某种聚合物的分子量，必须用它本身的标样作标定曲线。因此，SEC法不是测分子量的绝对方法，它是一种相对方法。标样的分子量要靠其他绝对方法测定。

其实SEC是按分子的尺寸来分离的，标定曲线应该是分子尺寸对淋出体积的图。

由Einstein公式知：

式中Vh是流体力学体积，而分子的尺寸是比例于Vh的，即比例于[η]M，所以近代的柱子用[ η ]M的对数对V _e 的曲线作为标定曲线。下图就是这种标定曲线。

因为[ η ]M= KMa-1，可写成

对于未知聚合物样品，只要它能溶解在与淋洗液相同的溶剂中，一旦测出它的淋出体积后，可以从标定曲线找出对应的[ η ]M值。根据未知样品的K和a值，可按式(1-20)算出它的分子量。

至于标定曲线的绘制，可用一组分子量不等的单分散性聚合物作为标样(常用的是阴离子聚合的聚苯乙烯)，分别测定它们的淋出体积和[ η ]M，得到如上图中的那段斜率为负值的直线，称为分子尺寸-淋出体积标定曲线。曲线的前后两段不成直线的部分表示对那些分子量太大或分子量太小的试样不能分离。

若光散射仪与SEC仪联用，在得到浓度谱图的同时还可以得到散射光强对淋出体积的谱图(上图中的曲线B)，从而可计算出分子量分布曲线和试样的各种平均分子量。计算中不需要标定曲线，使测定与计算工作大为简化。另外可以用SEC与自动黏度计联用，可测定支化聚合物的分子量分布和支化度分布。若紫外、红外等与示差折光仪结合的双检测器与SEC仪联机，可同时测定共聚物的组成分布和分子量分布。