ChemRxiv|​半胱氨酸氧化还原组亲核共价配体的发现

大家好，今天分享的是 2022 年 6 月发布于 ChemRxiv 预印本文章“ Nucleophilic covalent ligand discovery for the redoxome ”。文章通讯作者是来自美国 Scripps 研究所的 Kate S. Carroll 以及国家蛋白质科学中心的杨靖。

作为一种针对癌症的治疗策略，靶向共价抑制剂已成功应用于包括 EGFR 和 KRAS 突变体在内的那些历史上被认为是不可成药的靶点。利用化学蛋白质组学技术获得氨基酸侧链固有的化学功能，从建立的化合物库中筛选出识别人类蛋白质组的新配体是一种获得共价抑制剂的方法，文献已经报道了各种方法获得氨基酸侧链固有的化学功能，这些方法多是针对半胱氨酸以及其他亲核残基，包括赖氨酸、酪氨酸和天冬氨酸等。其中半胱氨酸是最具亲核性的氨基酸，反应性半胱氨酸靶向亲电片段和化学蛋白质组学技术的融合极大地促进了蛋白质组中可配体位点的发现。半胱氨酸残基还通过与外源性和内源性活性氧 / 氮 (RO/NS) 反应，因此，半胱氨酸体的化学反应性远远超出了还原的硫醇状态。

本文报道了一种针对人次磺酸化这一氧化形式半胱氨酸翻译后修饰亲核片段筛选的定量分析策略，发现了氧化形式的半胱氨酸虽然减弱了硫对亲电试剂的反应性，但却 为一类新的亲核共价配体 的发现 打开了大门 。

一、人类蛋白质组中半胱氨酸次磺酸反应性的定量分析

作者首先利用“可点击” 次磺酸 选择性探针 BTD 剂量依赖地标记蛋白质组，全面量化半胱氨酸次磺酸的反应性。该策略类似于用于评估亲核半胱氨酸和赖氨酸反应性的策略，基于所谓的“高反应性”次磺酸将在低 BTD 浓度下定量标记，而反应性较低的位点则表现出浓度依赖的增加的原则性的趋势。用 0.5 或 5 mM 的 BTD 处理 MDA-MB-231 细胞裂解液，随后对 BTD 标记的蛋白质组进行酶解和 click ，以同位素生物素进行富集、鉴定和定量 , 并将重标和轻标比值 (RH/L=R10:1) 低于 2.0 的半胱氨酸次磺酸定义为“高 反应性”次磺酸 （图 1 a.b ） 。作者发现与高反应性硫醇不同，高反应性次磺酸 在 UniProt 库中注释亲核功能的半胱氨酸中 并没有显著富集 ，对半胱氨酸次磺酸以及硫醇的反应性相关表明两者并未相关（图 1 c ），说明了半胱氨酸和密切相关的“氧化形式”之间化学反应性的根本差异 ; 也就是说，高反应性硫醇中的硫是亲核的，而高反应性 次磺酸中的硫是独特的亲电体。

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二、相同结合骨架的亲电性和亲核性片段具有不同的靶标轮廓

接下来，作者试图比较相同结合骨架但具有亲核或亲电反应弹头的化合物片段对这两个亚蛋白质组的化合物的配位性。分析半胱氨酸组选择了氯乙酰胺和丙烯酰胺弹头，而次磺酸组选择了氰基乙酰胺和硝基乙酰胺 （图 2 b ）。化合物片段或 DMSO 处理细胞裂解液后用硫醇或次磺酸反应探针标记并将 “配体位点” 定义为在每个片段存在的情况下，与对照相比， IPM 或 BTD 标记效率至少降低 4 倍（图 2 a ）。研究结果发现只有 tRNA 甲基转移酶 TRMT61A 的 C217 能够同时被 1 、 2 和 3b 配位 。结果表明，与半胱氨酸组相比，次磺酸具有更小但独特的配体空间 （图 2 d ） 。

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三、 亲核片段 - 次磺酸相互作用的全局分析

接下来，文章制备了 2016 年报道的 65 种亲电片段库的亲核类似物（图 3 a ），通过第二部分的实验流程发现，亲核片段库在人类次磺酸组的靶反应性方面表现出显著差异，大多数亲核片段显示配体率 <1.0% ，只有一种化合物 --5b 有明显更高的比率 。系统地研究亲核片段 结构特征与次磺酸基团反应性之间的关系表明具有游离 NH 基团的硝基乙酰胺片段比不含 NH 基团的硝基乙酰胺片段具有更高的反应活性，而分子量和 CLogP 对配体率没有明显影响（图 3 d ）。为了证实广泛反应的“ scouts ”片段 5a 和 5b 的反应性，合成了 10a 和 10b 的炔烃类似物标记次磺酸组，研究结果发现，与 10a 相比，片段 10b 显示出更大的蛋白质组标记（图 3 i ） 。这些研究结果进一步支持了片段支架驱动配体性，而不是蛋白质组次磺酸的固有亲电反应性。

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四、亲核片段的配体性影响多种蛋白质的功能

在随后的研究中，作者评估了 “ scouts ”片段 5b 调节蛋白质生物学功能的能力。 PRXL2A 作为一种过氧化物酶，含有一个 5b 配位位点 (C85) ， PRXL2A 可以抵消 MAPK 信号。 5b 片段处理激活了 MAPK 信号， p38 和 ERK 磷酸化以浓度依赖的方式上调 ( 图 4f) 。为了证实这种效应是 C85 片段 5b 配体的直接结果，在转染野生型 (WT) 或突变 PRXL2A 质粒的 MDA-MB-231 细胞中研究了 C85S 突变的影响 ， 该突变显著减弱了片段 5b 诱导的 MAPK 信号的激活 ( 图 4g) 。这表明该片段在细胞中少部分地介导了 PRXL2A 的氧化还原活性。

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总之，文章采用了称为 SulfenQ 的定量化学蛋白质组学平台来量化蛋白质次磺酸化的内在反应性，并系统地筛选了天然蛋白质组中针对人类次磺酸组 (> 8200 个位点 ) 的亲核试剂片段库 。