大家好，今天给大家分享的文章是2023年发表在
Nature Immunology
上，题为：
Defining blood-induced microglia
functions in neurodegeneration through multiomic profiling
。
本文通
过建立血液先天免疫多组学和遗传功能丧失通道，将纤维蛋白定义为
MS
和
AD
小鼠小胶质细胞极化为氧化应激和神经退行性表型所需的独特血液蛋白。
证明了血液诱导的先天免疫极化是诱导疾病中神经毒性小胶质细胞编程的因果关系。
同时揭示了由免疫和血管信号诱导的不同转录组学和磷酸化蛋白质组学事件的原理，以及它们对自身免疫和神经退行性疾病中免疫多样性的贡献。
研究背景：
血管和免疫信号是大脑和外周多种自身免疫性疾病、炎症和传染病中先天免疫反应的有效激活剂。先天免疫细胞整合环境信号以快速激活靶基因并执行专门的细胞功能。小胶质细胞的致病性激活会促进阿尔茨海默病
(AD)
和多发性硬化症
(MS)
的氧化应激、炎症和神经变性。血脑屏障（
BBB
）破坏是与小胶质细胞激活，神经变性和
MS
，
AD
和其他神经系统疾病的进展相关的早期病理特征。血脑屏障破坏后，有毒的血液蛋白质会渗入大脑，改变大脑周围环境。凝血和补体途径是先天免疫的关键激活剂，在衰老、癌症以及神经、精神和传染病中受到共同调节。凝血蛋白纤维蛋白原在血管损伤部位转化为不溶性纤维蛋白，并通过
CD11b–CD18
整合素受体（也称为补体受体
3 (CR3)
、
αMβ2
或
Mac-1
）诱导小胶质细胞活化和神经变性，
CR3
还结合具有多种免疫调节功能的其他结构上不相关的配体，包括补体蛋白
iC3b
（它通过吞噬作用调节突触、病原体和碎片清除）。然而，小胶质细胞如何在脑血管损伤部位整合细胞外信号以及疾病中控制先天免疫细胞极化的血液蛋白的特异性仍然知之甚少
研究结果：
为了确定小胶质细胞中血液诱导的转录组，作者将野生型(WT)血浆立体定向递送至大脑，然后对分选的小胶质细胞进行RNA测序(RNA-seq)分析（1a）。通过对差异表达基因（DEG）、GO和KEGG途径的分析，发现WT血浆诱导了广泛的小胶质细胞转录变化，包括涉及与氧化应激相关基因的变化（Hmox1、Romo1）、疾病相关小胶质细胞(DAM)（Cst7、Spp1）以及氧化磷酸化、神经退行性变等方面的变化（1b-e）。而这些变化在用来自纤维蛋白原缺陷型Fga-/-小鼠的血浆刺激后基本不存在，但在补体3缺陷型(C3-/-)或白蛋白缺陷型(Alb-/-)血浆刺激后相对保留（1b、c）。当血浆来自Fga−/−小鼠时，血液诱导的小胶质细胞基因网络中的基因数量减少了97%，其中52%的基因显著下调（1f），表明纤维蛋白原是血液中诱导小胶质细胞激活的关键蛋白质。通过对Fga−/−和WT血浆刺激的小胶质细胞之间的DEG进行KEGG通路分析，作者确定了纤维蛋白原诱导的12条主要通路，包括ROS（Hmox1）等（1e，g）。Fggγ390-396A小鼠的纤维蛋白原已突变为缺乏CD11b-CD18结合基序，与WT血浆相比保留了正常的凝血功能。Fga-/-和Fggγ390-396A血浆诱导了小胶质细胞中主要基因表达的变化（1c）。这些结果表明，血液蛋白在诱导小胶质细胞转录变化方面存在特异性，表明纤维蛋白原信号传导是血液中BBB渗漏后诱导小胶质细胞氧化应激和疾病诱导特征的关键调节因子。
2.
单细胞
RNA-seq
揭示了不同的纤维蛋白和
iC3b
基因特征
为了确定先天免疫细胞如何响应免疫和血管信号而极化，作者首先使用纤维蛋白、补体iC3b及LPS分别刺激原代小胶质细胞从而生成单细胞RNA-seq(scRNA-seq)图谱（2a-e）。DEG的基因集富集分析(GSEA)确定了控制氧化应激和氧化还原调节的纤维蛋白诱导基因（Cybb）和1型干扰素(IFN)刺激基因(ISG)家族（Isg15），它们在簇4“Mg-纤维蛋白簇”中选择性富集（2f）。iC3b处理的细胞与纤维蛋白处理的细胞重叠（簇0、1、5和6；称为“纤维蛋白-iC3b簇”），其特征在于1,184个共调节基因，其中111个基因(~9%)与LPS-重叠诱导的基因反应（2c、d）。纤维蛋白和iC3b均诱导和氧化应激途径（Hmox1）、磷脂代谢（C1qa、Sepp1）等（2f）相关通路。LPS激活了炎症反应的基因表达程序，以及小胶质细胞中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性（2f）。这些结果突出了小胶质细胞中的配体选择性基因通路。
接下来，作者对未刺激或用纤维蛋白、补体iC3b及LPS处理的小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)进行了类似的分析。与小胶质细胞一样，BMDM主要聚集成不同的配体诱导的转录状态，其中富含纤维蛋白的簇（簇1、2、5和6；称为“BMDM-纤维蛋白簇”）、iC3b（簇0；称为“BMDM-补体簇’）和LPS（簇4和5；称为“BMDM-LPS簇”）（3a-d）。通过GSEA鉴定了纤维蛋白诱导基因，结果显示这些基因与氧化应激等有关（3d，e）。而BMDM-补体簇的GO分析显示宿主防御反应、骨髓细胞分化等途径富集（3d,e）。通过GO分析显示抗病毒基因特征在纤维蛋白和iC3b簇中同时存在（3e）。LPS簇在MAPK活性、炎性细胞因子和趋化因子产生以及趋化性（如Il1b、Il6和Tnf）的基因通路中富集（3d）。这些结果表明纤维蛋白极化主要促进促氧化剂、脂质代谢和IFN-I反应，而补体iC3b和LPS分别诱导宿主防御和经典炎症状态。
3.
磷酸化蛋白质组学揭示不同的纤维蛋白和
iC3b
信号
作者使用质谱法进行了定量磷酸化蛋白质组学，以全面表征RAW264.7巨噬细胞中对于补体iC3b或纤维蛋白刺激的蛋白质磷酸化动力学。结果显示两者之间存在磷酸化动力学差异，纤维蛋白诱导整体磷酸化水平相对于iC3b的诱导程度增加。接下来，作者生成了纤维蛋白和iC3b磷酸化蛋白质组相互作用网络。纤维蛋白诱导蛋白质的强烈磷酸化，包括整合素相关粘着接头蛋白桩蛋白(PXN)等蛋白的磷酸化（4a）。iC3b诱导死亡结构域相关蛋白(DAXX)等蛋白的磷酸化（4a）。功能富集鉴定了由纤维蛋白诱导的差异途径，包括“VEGF信号”等，以及由iC3b诱导的差异途径，包括“RNA代谢过程的调节”等（4c）。磷酸蛋白质组学GO通路相互作用网络表明，纤维蛋白诱导“细胞骨架组织”和“催化活性正调节”网络的动态调节，而iC3b导致“细胞应激反应”和“转录负调节，DNA模板”的持续激活交互网络。
因为磷酸化信号级联的调节主要由蛋白激酶介导，因此为了预测激酶
-
底物关系，作者从磷酸化蛋白质组学数据中通过生物信息学计算了激酶活性。
结果显示在两者分别处理后导致不同激酶发生不同程度的激活（
4d
）。
这些结果表明纤维蛋白和
iC3b
诱导不同的磷酸化和激酶活性，表明血液蛋白在先天免疫细胞中诱导不同的信号转导途径。
接下来，作者验证了
BMDM
、原代小胶质细胞和
AD
小鼠脑组织中被纤维蛋白磷酸化的主要蛋白质。
纤维蛋白诱导
BMDM
和原代小胶质细胞中第
83
位残基
(p-PXN)
桩蛋白的动态磷酸化（
4e
、
f
）。
纤维蛋白在
BMDM
和小胶质细胞中诱导
MEK2
在残基
394(p-MEK2)
处的强烈磷酸化（
4e
、
g
）。
特异性
MEK2
抑制剂曲美替尼阻断
p-MEK2
并降低纤维蛋白处理的
BMDM
中纤维蛋白诱导基因
Il1b
的表达，表明
MEK2
激活介导纤维蛋白诱导的促炎基因表达。
治疗性单克隆
5B8
抗体将纤维蛋白结合位点靶向
CD11bI
结构域而不影响纤维蛋白聚合，在纤维蛋白处理的
BMDM
中阻断
p-MEK2
（
4h
），表明纤维蛋白诱导的磷酸化是受体介导。
纤维蛋白诱导
BMDM
和原代小胶质细胞中
p-NCF2
的磷酸化，为了测试
NCF2
是否在体内疾病模型中被磷酸化，作者评估了
5XFAD
小鼠大脑中的
NCF2
表达和激活。
5XFAD
中的
p-NCF2
和总
NCF2
高于对照小鼠（
4i
）。
这些结果表明纤维蛋白作为
CD11b–CD18
配体，偶联整合素信号与
NADPH
氧化酶激活。
4.
纤维蛋白驱动
MS
小鼠的神经毒性先天免疫程序
由于转录组学和磷酸化蛋白质组学分析都确定氧化应激是纤维蛋白诱导的关键途径，因此作者对纤维蛋白、iC3b和LPS基因特征与氧化应激中枢神经系统(CNS)先天免疫特征进行了叠加。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中，对产生氧化应激的细胞(Tox-seq)进行单细胞RNA测序，识别出偏向于氧化应激的不同细胞亚群（MgV和MpI簇），而其他细胞则富含抗原呈递和吞噬基因（MgIII和MpIII簇）。作者发现纤维蛋白或LPS的刺激概括了EAE中ROS+小胶质细胞和巨噬细胞表达的核心氧化应激特征（Ncf2、Cybb、Sod2和Irg1）（5a、b）。纤维蛋白刺激的细胞在产生氧化应激的小胶质细胞群（MgV促氧化标记Clec4e、Saa3、Stat1和Ifitm3）和来自EAE的浸润性巨噬细胞（MpI促氧化标记Clec4e、Hmox1、Cxcl10和Lilrb4）中鉴定出的促氧化基因表达最高（5b）。小胶质细胞共有的iC3b-纤维蛋白基因特征（如C1qc、Sepp1）在EAE小胶质细胞抗原呈递MgIII簇中富集（5a、b）。BMDM iC3b基因特征在EAE巨噬细胞簇MpV和MpVI中富集（5a，b），根据它们的基因表达程序，它们被鉴定为吞噬亚群。所有治疗均显著下调稳态小胶质细胞基因特征（如Cx3cr1和Cst3）（5b）。这些数据表明，纤维蛋白和补体iC3b是神经炎症损伤中的有效信号，它概括了功能特异性先天免疫反应的极化，表明纤维蛋白是小胶质细胞和外周巨噬细胞中氧化应激基因程序的有效诱导剂。
5.
纤维蛋白驱动
AD
小鼠的神经毒性小胶质细胞程序
作者使用Tox-seq分析NTG对照或5XFAD小鼠大脑中通过scRNA-seq标记的ROS产生的CD11b+细胞的转录组。使用聚类分析叠加功能性ROS表征，作者确定了四个转录不同的CD11b+簇，包含ROS+和ROS-细胞群（6a、b）。来自5XFAD小鼠的大多数ROS+小胶质细胞（50%的细胞）被发现在小胶质细胞簇4（簇Mg4）中（6b），其富集了参与神经退行性小胶质细胞激活和铁转运的基因（如Apoe、Tyrobp和Fth1)（6c、d）。而已知负向调节ROS产生、超氧化物代谢和维持小胶质细胞稳态特征的基因在来自5XFAD小鼠的ROS-小胶质细胞中增加（分别为Nrros、Clk1和Zeb2）（6c、d）。差异基因表达分析显示，与NTG小鼠的ROS-小胶质细胞相比，ROS+几乎没有变化。两个5XFAD小胶质细胞簇的功能子簇分析表明，子簇0具有最高的ROS+小胶质细胞单细胞表达（6e，Tox-seq簇叠加）。纤维蛋白诱导基因在亚群0中富集（6e，纤维蛋白特征覆盖）。ROS+小胶质细胞显著富集了纤维蛋白诱导基因和iC3b-纤维蛋白诱导基因，但没有LPS诱导基因（6f）。
为
了测试纤维蛋白是否是小胶质细胞向神经毒性表型极化所必需
的，作者将
5XFAD
与
Fggγ390-396A
小鼠杂交，并通过
scRNA-seq
分析小胶质细胞。
作者对来自
5XFAD
：
Fggγ390-396A
、
5XFAD
、
Fggγ390-396A
和
NTG
同窝的
CD11b+
细胞进行了
scRNA-seq
（
7a
、
b
）。
与
5XFAD
小鼠相比，
DAM
簇
1
和
2
的差异基因表达分析在
5XFAD:Fggγ390–396A
的小胶质细胞中鉴定出
487
个上调基因和
1
78
个下调基因（
7c
）。
在
5XFAD:Fggγ390–396A
小鼠中，小胶质细胞稳态基因是最上调的基因（
Cx3cr1
、
Siglech
、
Runx1
），而纤维蛋白诱导基因（如
Fth1
、
Rnase4
、
Mif
）和已知的
DAM
标记（如
Cst7,Apoe,Tyrobp)
是下调最多的基因（
7c
）。
神经退行性小胶质细胞基因特征在
5XFAD:Fggγ390-396A
小鼠中显著降低，而小胶质细胞稳态基因在对照水平表达（
7d
）。
5XFAD:Fggγ390–396A
小鼠中下调的神经退行性特征与
TREM-2
相关基因（
Tyrobp
、
CD68
、
Cst7
）、铁结合基因（
Fth1
、
Ftl1
）和脂质结合基因（
Apoe
、
Fabp5
）相关（
7e
）。
为了验证这些变化，作者使用
DAM
和氧化应激标记载脂蛋白
E(APOE)
和
GP91phox
在
5XFAD
和
5XFAD:Fggγ390–396A
小鼠的大脑中进行了免疫组织化学。
与
5XFAD
小鼠相比，
5XFAD:Fggγ390–396A
中淀粉样斑块周围双阳性
APOE/GP91phox
细胞的频率降低（
7f
），表明淀粉样斑块周围的
Apoe
基因表达和产生氧化应激的
DAM
依赖于纤维蛋白。
总这些结果表明，纤维蛋白
-CD11b
信号驱动关键的小胶质细胞通路，包括
TyroBP
、脂质代谢和神经变性中的氧化应激反应。
6.AD 和 MS 小鼠共有的纤维蛋白小胶质细胞特征
作者比较了5XFAD和EAE模型之间小胶质细胞的Tox-seq转录组学概况。
在来自EAE小鼠的ROS+小
胶质细胞中鉴定的氧化应激核心特征也存在于5XFAD小鼠中（8a）。
尽管在EAE和5XFADROS+小胶质细胞（Apoe）之间共有67个DEG，但大多数基因对5XFAD（132DEG）或EAE（170DEG）具有特异性，分别为Igf1和Il1b（8b，c）。
对EAE和5XFAD模型共有的小胶质细胞氧化应激基因的通路分析确定了与凝血和止血（如Plaur）、抗原呈递（如H2-Ab1）相关通路的富集）、中性粒细胞脱颗粒（如B2m）和酪氨酸激酶结合蛋白Tyrobp网络（8d）。
接下来，作者将共有的AD和EAE氧化应激特征与血液诱导的小胶质细胞谱重叠（8e）。
WT血浆特征与共有的氧化应激小胶质细胞特征重叠，表明数据集比对识别了MS和AD小鼠中血液诱导的小胶质细胞基因。
Fga-/-血浆大大降低了氧化应激和疾病相关转录物至
控制水平（8e），表明纤维蛋白原是血液中激活神经退行性小胶质细胞反应的关键配体。
这些数据表明纤维蛋白诱导的小胶质细胞极化在MS和AD的神经变性中具有致病作用，证明了先天免疫驱动的神经毒性的共同和独特驱动因素。
通
过建立血液先天免疫多组学和遗传功能丧失通道，作者将纤维蛋白定义为
MS
和
AD
小鼠小胶质细胞极化为氧化应激和神经退行性表型所需的独特血液蛋白。
证明了血液诱导的先天免疫极化是诱导疾病中神经毒性小胶质细胞编程的因果关系。
同时揭示了由免疫和血管信号诱导的不同转录组学和磷酸化蛋白质组学事件的原理，以及它们对自身免疫和神经退行性疾病中免疫多样性的贡献。
