中国医学科学院刘芝华/清华大学杜亚楠Biomaterials：基于明胶的3D仿生支架平台促进食管鳞状细胞癌中癌症干细胞的培养

食管癌是全球最常见的恶性癌症之一，主要高发于亚洲国家。在中国，超过90%的食管癌为食管鳞癌（ESCC），由于诊断较晚和缺乏有效治疗方法，食管癌预后较差，总5年生存率约为20%。肿瘤干细胞是肿瘤细胞中一群拥有自我更新能力的细胞，其通常处于相对静止的细胞周期，而在某些刺激因子作用下重新进入细胞周期从而快速增殖的能力，表明它们在食管鳞癌的发生，转移，化学抵抗和放射耐药性中起重要作用。然而，缺乏理想的体外培养模型给肿瘤干细胞的进一步研究和靶向治疗的开发带来了障碍。

最近的研究表明，干细胞的自我更新和未分化状态依赖于一种特殊的微环境，涉及与各种细胞类型和细胞外基质之间的相互作用，这种干细胞存在的微环境称为“CSC niche”（干细胞龛）。在多种实体肿瘤中，基于对肿瘤微环境的研究，已经广泛探索了各种培养系统，其中包括去细胞化组织、仿生基质、个性化水凝胶和混合生物材料。然而，尚未为食管鳞癌肿瘤干细胞建立能够模拟天然微环境的3D培养体系。3D仿生支架因它们能够模仿自然微环境的干细胞生态位，ECM蛋白和刚度的特性以及快速扩增细胞的能力被广泛用于扩增干细胞。

【 研究概要 】

2023年9月11日， 中 国医学科学院肿瘤医院 刘芝华教授 和 清华大学 杜亚楠教授 团队合作在《 Biomaterials 》杂志（IF=14）在线发表了题为“Gelatin-based 3D biomimetic scaffolds platform potentiates culture of cancer stem cells in esophageal squamous cell carcinoma” 的工作， 揭示了生物材料的粘弹性对食管鳞癌肿瘤干细胞体外3D培养的关键作用，发现接近于食管鳞癌组织粘弹性的高粘度3D支架（G’: 6–403 Pa; G’’：2-75 Pa）能更好地支持食管鳞癌肿瘤干细胞的富集，其中TGF-beta信号通路参与调控肿瘤干性。该新建立的基于明胶的3D仿生支架平台为肿瘤干细胞的机制研究以及靶向治疗策略的开发奠定了基础。（图1）

图1.研究总览

【 研究内容 】

研究人员首先利用生物信息学的方法和光镊技术系统地研究了食管组织的胶原沉积和粘弹性，这可以为更好地重现肿瘤微环境提供基础。光镊测量发现食管鳞癌癌组织的生理粘弹性范围是(G’: 32–531 Pa; G’’: 3–173 Pa)，癌旁组织是(G’: 116–1016 Pa; G’’: 23–354 Pa)。另外，通过对食管鳞癌的转录组分析发现，相较于癌旁组织，COL1A1和COL11A1在癌组织中大量积累。（图2）

图2. 食管鳞癌组织及其癌旁组织的粘弹性测定和matrisome（基质组）分析

研究人员接下来基于食管组织的生理粘弹性数据和胶原沉积情况，通过化学交联剂（EDC）控制交联程度，冷冻保护剂控制孔径大小，冷冻明胶（部分水解的胶原蛋白）的方法制备了三种不同粘弹性的3D支架（高粘度: G’= 6–403 Pa, G’’= 2–75 Pa; 中等: G’ = 191–2558 Pa, G’’ = 3–128 Pa; 高弹性: G’ = 479–4689 Pa, G’’ = 6–112 Pa）。（图3）

图3. 定制化仿生3D支架的制备及表征

随后研究者发现，食管鳞癌细胞在3D支架系统中高效增殖，其中高粘度3D支架能更好地支持食管鳞癌细胞的克隆扩增，2-3天便能形成直径大于50μm的克隆，其扩增速度远高于传统的3D悬浮和基质胶培养。转录组分析表明，粘弹性调节关键干性标志物的表达和TGF-beta信号通路的富集。同时，研究者利用一系列体外实验分析表征了食管鳞癌细胞在2D培养条件以及3D高粘度，中等，高弹性支架上的细胞形态，活力，干性标志物和TGF-beta信号通路的关键基因的表达水平。这些数据进一步验证了转录组的分析结果，证明了接近于食管癌组织生理粘弹性的高粘度3D仿生支架平台更有利于食管鳞癌肿瘤干细胞的体外快速扩增。（图4）

图4. 食管鳞癌细胞的体外扩增和干性验证

肿瘤形成能力是肿瘤干细胞最重要的特征之一，研究者最后利用小鼠皮下瘤模型进一步验证了高粘度仿生支架在体内显著促进了食管鳞癌细胞的扩增。（图5）

图5. 体内成瘤试验

【 研究结论与意义 】

综上，本研究首次建立了适于食管鳞癌肿瘤干细胞体外扩增的3D仿生支架平台，该平台模拟了食管鳞癌组织的粘弹性和细胞外基质的胶原蛋白成分，可以高效地在体外富集肿瘤干细胞。结合一系列体内外实验揭示了粘弹性对于肿瘤干细胞体外培养的重要性，发现了高粘度3D仿生支架(G’: 6-403 Pa; G’’: 2-75 Pa)更有利于食管鳞癌肿瘤干细胞的体外扩增培养，其中TGF-beta信号通路在粘弹性改变的情况下参与了干性的调控。由此，该平台为将来肿瘤类器官的高通量培养，肿瘤干细胞的机制研究及靶向治疗策略开发等奠定了一定基础。

【 作者介绍 】

清华大学 杜亚楠 教授和中国医学科学院肿瘤医院 刘芝华 教授为该论文的共同通讯作者，中国医学科学院肿瘤医院博士后 伍椰南 和清华大学博士后 梁海威 为该论文的共同第一作者。该研究得到了国家重点研发计划 (2021YFC2501000) , 国家自然科学基金 (82030089, 82188102), 医科院创新工程 (2021-I2M-1-018, 2021-I2M-1-067)的支持。

【 团队介绍 】

杜亚楠 ，清华大学医学院教授，清华北大生命联合中心研究员，博士生导师，国家自然科学基金“杰出青年”项目获得者、北京市自然科学基金“杰出青年”获得者、教育部青年长江学者奖励计划、国家自然科学基金“优秀青年”项目获得者。本科毕业于清华大学化学工程系；博士毕业于新加坡国立大学生物工程系；于美国麻省理工学院和哈佛医学院进行博士后研究。杜亚楠教授在“微组织工程”这一特色交叉研究方向进行创新探索，实现理论探究和技术转化。团队开发的3D微组织技术，可作为新一代干细胞药物的扩增制备平台和药剂学递送系统革新再生医学；并通过构建体外仿生病理微组织模型首次报道了肝窦毛细血管化可通过胶原纤维介导的“旁张力信号”促进肝脏纤维化的全新病理机制，为治疗组织纤维化促进组织再生提供了新手段。共发表高影响力SCI论文100余篇 (发表在 Nature Materials，Nature BME，Nature Communications, PNAS，Science Advances  等杂志)。同时为国内外期刊Tissue Engineering，Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine; ACS Biomaterials Science & Engineering和 Cell Regeneration 编委。批准授权专利20余项，微组织工程技术已实现商品化，相关产品获得美国FDA和中国药监局首款细胞药用辅料资质，并获得29届日内瓦国际发明金奖。获得第二十四届中国科协求是杰出青年成果转化奖。

刘芝华， 中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室研究员，北京协和医学院博士生导师。中国医学科学院肿瘤医院副院长，分子肿瘤学国家重点实验室主任。国家杰出青年基金获得者，教育部特聘教授，国家高层次人才项目领军人才，教育部创新团队及科技部创新团队负责人，首批人社部新世纪“百千万人才工程”国家级人选，卫生部有突出贡献中青年专家，享受国务院政府特殊津贴。北京大学本科、博士，美国华盛顿州立大学博士后。主持重点研发计划慢病项目、常见多发病防治研究项目，国家自然科学基金重点项目及重点国际合作项目等。刘芝华研究组的主要研究方向是从遗传、表观遗传和肿瘤微环境协同调控的角度探讨肿瘤发生发展的分子机制，识别具有临床应用前景的分子分型标志物和新靶点，多层面构建肿瘤个体化精准诊疗的分子基础。长期致力于通过多组学数据鉴定食管癌驱动基因，对食管癌进行精确分子分型，鉴定新型预后标志物和治疗靶点，发展新型治疗策略。在 Cancer Cell, Cell Research, Advanced Materials, Nature Communications, Advanced Science, PNAS 等杂志发表通讯作者论文百余篇，被引用1万余次，H index 58。研究成果获国家科技进步一等奖、中华医学科技一等奖和抗癌协会科技奖一等奖等。