JHM专栏｜深圳大学刘斌团队：快速、便携、选择性、比例测定赭曲霉毒素A (OTA)的荧光超分子传感器
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第一作者： 张铭元
通讯作者： 刘斌
通讯单位： 深圳大学
论文DOI： 10.1016/j.jhazmat.2023.133104
图片摘要
成果简介
近日，深圳大学刘斌副教授团队在期刊Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Fast, portable, selective, and ratiometric determination of ochratoxin A (OTA) by a fluorescent supramolecular sensor”的研究性论文。探索了一种新的超分子传感器DOCE@ALB，以人血清白蛋白为宿主，类黄酮荧光指示剂为客体。在指示剂置换（IDA）测定的基础上实现了可识别的颜色变化和传感器的便携性现场检测真实的食品样品中的OTA。
全文速览
赭曲霉毒素A (OTA)是一种存在于各种食品中的霉菌毒素，由于其致癌和有毒特性，对健康具有重大风险。因此，检测OTA对确保食品安全至关重要。在已报道的分析方法中，还没有一种方法能够实现快速、选择性和便携的OTA检测。在这项研究中，我们探索了一种新的超分子传感器DOCE@ALB，以人血清白蛋白为宿主，类黄酮荧光指示剂为客体。在指示剂位移测定的基础上，该传感器具有仅5 s的超快速响应时间，灵敏度高，检测限为0.39 ppb，具有出色的选择性，并且对OTA具有显着的比例荧光响应。这种可识别的颜色变化和传感器的便携性使其适用于现场检测食品样品中的OTA，包括面粉，啤酒和葡萄酒，只需使用智能手机。与以前报道的方法相比，我们的方法在响应时间和便携性方面都显示出显着的优势，解决了食品安全法规政策的关键需求。
引言
赭曲霉毒素A (Ochratoxin A, OTA)曲霉菌等真菌属产生的初级真菌毒素和次生真菌代谢物。它经常在食品(包括谷物及其衍生物、啤酒、葡萄酒、香料和咖啡)的生产、加工、储存和运输过程中产生，主要是由于处理方法不当造成的。这种污染可以通过环境水系统和动物饲料延伸到整个食品供应链，造成牲畜健康问题，从而造成巨大的经济损失。已有研究表明，OTA可以渗透到人类和动物的食物链中，对人类和动物的健康产生严重的有害影响，如致癌性、肾毒性、肝毒性、遗传毒性和神经毒性。因此，OTA已被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类致癌物。欧盟委员会制定了严格的指导方针，规定食品中OTA的最大允许残留量为0.5至30 ppb。同样，中国食品安全国家标准GB2761-2017规定，食品中OTA的最大允许残留量(MRL)应在2-10 ppb范围内。因此，开发食品中OTA的可靠分析方法具有至关重要的意义。
已经有几种检测OTA的方法。传统方法包括高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)和高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS/MS)。虽然这些方法具有良好的灵敏度和准确性，但它们通常需要昂贵的仪器，专业的操作人员和复杂的样品制备过程。这些缺点使它们无法方便、快速地检测实际样品中的分析物。与传统方法相比，荧光方法具有响应快、灵敏度高、选择性高、可直接裸眼观测定目标物等特点。目前，已有大量荧光探针报道用于OTA检测。大多数荧光探针为适配体传感器，利用OTA特异性适配体作为识别片段。然而，这些感应传感器的反应时间往往较长(＞10分钟)，这是由于修饰引起的与OTA的亲和力降低和适体重构过程缓慢。其他荧光方法都有各自的缺点，如灵敏度差、便携性差、适用范围窄等。因此开发一种能够快速、方便地检测实际食品样品中OTA的方法是迫切需要的。
图文导读
DOCE@ALB荧光探针的设计
Scheme 1. (a) Chemical structures of common mycotoxins. (b) Binding modes and binding energies of mycotoxins with human serum albumin (ALB, protein data bank: 4K2C) calculated by the molecular docking technique (AutoDock 4.0). (c) Chemical structure of screened dye DOCE and its binding complex with ALB. (d) Proposed IDA-sensing mechainsm of DOCE@ALB as a supramolecular sensor for the selective detection of OTA.
近年来，基于主客体相互作用的超分子识别系统在传感领域的应用越来越受到关注。这些系统依赖于通过靶分子和光学指示剂之间的竞争性结合过程产生的信号响应，称为指示剂置换测定(IDA)。IDA检测以其对目标分子的超快响应时间(以秒为单位)而闻名，因为它们对非共价键的变化敏感，而不是基于反应的化学传感器中的共价键的变化。如方案1a所示，当食物被霉菌污染时，OTA与各种真菌毒素同时产生，如黄曲霉毒素B1 (AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、桔霉素、脱氧雪腐镰刀菌醇(DON)和展青霉素。研究表明，这些真菌毒素均可与人血清白蛋白(ALB)的药物位点1 (DS1)结合。采用分子对接技术(方案1b)，我们计算了真菌毒素与ALB之间的结合能，得到的值为−10.35至−5.35 (kcal/mol)。值得注意的是，OTA与ALB的结合亲和力最高。基于IDA原理，我们假设通过使用一种与ALB结合能恰好落在OTA和其他真菌毒素之间的合适荧光指示剂，只有OTA才能有效地将指示剂从其ALB复合物置换为自由分子形式。这个位移过程会触发指示剂的荧光变化，从而可以选择性地检测OTA。
如方案1c所示，我们从染料库中成功筛选了一种荧光指示剂 2-(4-(dimethylamino-)styryl)− 4-oxy-4 h-chrome-3–2-ethylbutyrate (DOCE)。计算得到DOCE与ALB的结合能(- 8.59 kcal/mol)介于OTA与其他真菌毒素之间。理论上，这种情况可以使OTA有效地将DOCE从其ALB结合复合物中取代，而其他真菌毒素则不能(方案1d)。在此基础上，我们利用DOCE-ALB结合复合物(DOCE@ALB)作为OTA检测的主客超分子传感器。该传感器具有超快的响应时间(5秒)、高灵敏度(检测限为0.39 ppb)、出色的选择性、从黄色到蓝色的显著发射颜色变化，可以用智能手机或肉眼分辨。此外，该传感器在微型传感装置的辅助下，已成功用于面粉、啤酒、葡萄酒等真实食品样品的OTA现场检测。据我们所知，这项工作标志着一种用于OTA检测的快速便携式荧光方法的开创性实施。
Fig. 1. Binding behavior between DOCE and ALB. (a) Absorption and fluorescence spectra of DOCE (10 μM) dissolved in common organic solvents, including toluene, ethyl acetate (EA), dichloromethane (DCM), dimethyl sulfoxide (DMSO), acetonitrile (ACN), EtOH, and MeOH, respectively. (b) Fluorescence spectra of DOCE (10 μM) with increasing concentration of ALB (0 – 10 μM) in PBS (10 mM, pH ∼ 7.4). λ = 400 nm. (c) Job’s plot analysis based on the peak intensities (575 nm) of the mixtures of DOCE and ALB with different ratios, while their overall concentration remains at 10 μM. (d) Fluorescence decay curves of DOCE (10 μM) in the presence and absence of ALB (10 μM) in PBS. IRF: instrument response function (prompt). Laser source is a 392 nm NanoLED. (e) Binding mode of DOCE@ALB calculated by the AutoDock 4.0. ALB and DOCE are colored in gray and black, respectively. (f) 2D diagram of DOCE@ALB processed by the Ligplot. The dash lines represent the possible intermolecular hydrogen bonds between DOCE and amino acid residues in ALB.
记录DOCE的吸收光谱和荧光光谱(图1a)。其主吸收峰在370 ~ 450 nm范围内，发射峰在500 ~ 600 nm范围内与极性高度相关。在水中，DOCE的荧光强度最小，但加入ALB后，其荧光逐渐增强，在575 nm处出现一次发射峰，并出现蓝移(图1b)。这种蓝移是由于位于高极性水环境中的DOCE与ALB结合后，进入ALB的低极性结合口袋，导致观察到的荧光蓝移。如图1c所示，Job’s plot的图明确地表明DOCE和ALB可以以1:1的摩尔比形成结合络合物。此外，与ALB相互作用后，DOCE的荧光寿命从1.29 ns延长至1.93 ns，表明与ALB的结合限制了DOCE的分子内旋转(RIR)(图1d)。利用分子对接技术计算DOCE@ALB可能的结合模式(图1e-1f)。结果表明，DOCE可能与OTA结合到相同的药物位点(DS1) 。
Fig. 2. Sensing performance of DOCE@ALB for OTA. (a) Time-dependent intensity (575 nm) of DOCE@ALB (1 μM) in the presence and absence of OTA (1 μM) in PBS (0.1 mM, pH ∼ 7.4). λ = 400 nm. (b) Fluorescence spectra of DOCE@ALB (1 μM) upon addition of the increasing concentrations of OTA (0 – 1 μM). Inset: photographs of DOCE@ALB in the presence of OTA under excitation of a handheld UV lamp (365 nm). (c) The emission color change toward OTA on a CIE 1931 graph. (d) Dependence of (d) peak intensties (450 nm and 575 nm) and (e) intensity ratio (I450/I575) of DOCE@ALB (1 μM) on the concentrations of OTA. LOD: limit of detection. (f) Intensity ratios of DOCE@ALB (1 μM) in the presence of different mycotoxins (1 μM), including OTA, AFB1, patulin, citrinin, ZEN, and DON, respectively. (g) Intensity ratios of DOCE@ALB (1 μM) in the presence (red bars) and absence (black bars) of OTA (1 μM) coexisting with different interferring components (1 μM). Components No. 1–21: K+, Na+, Mg2+, Cu2+, Zn2+, Ca2+, CO32-, SO42-, SO32-, NO3-, NO2-, Br-, I-, glucose, fructose, sucrose, lactose, serine, glutamic acid, proline, arginine. c: control. λex = 400 nm. Error bars = ± SD.CPF (40 μM) in the presence of (g) ions (No. 1-9: Mg2+, Ca2+, Na+, CO32-, Cl−, I-, SO42-, NO2-, and SO32-) (h) amino acids (No. 1-6: lysine, leucine, tryptophan, glutamic acid, proline, and serine) in PBS buffer, respectively. [ions] = [amino acids] = 300 μM. λex = 370 nm.
全面评估了DOCE@ALB对OTA的传感性能。如图2a所示，DOCE@ALB的荧光强度对紫外激发具有很高的稳定性。加入OTA后，DOCE@ALB的强度在5 s内急剧下降，并持续至少10 min，表明响应时间超快，读出时间窗口宽。从图2b可以看出，随着OTA浓度从0 μM增加到1 μM, DOCE@ALB在575 nm处的荧光强度逐渐减弱，这是因为DOCE被ALB结合袋中的OTA取代。同时，在450nm处出现了一个新的发射峰。这归因于OTA与ALB结合后的固有荧光。这一结果最终导致了对OTA的比例荧光响应，并伴随着发射颜色从黄色到蓝色的转变。通过International Commission on Illumination (CIE)的图表(图2c)，可以更清楚地了解这种颜色的转变。从图2d -2e可以看出，在0.01 ~ 0.4 μM的浓度范围内，强度比(I450/I575)与OTA呈较强的线性关系(R2 = 0.99)。检测限(LOD)为0.99 nM (0.39 ppb)，低于欧盟和中国标准规定的MRL。
通过质谱分析(MALDI-TOF-MS)验证了其传感机理 (Supporting Information)。接下来，我们对DOCE@ALB对六种常见真菌毒素的选择性进行了评估，包括OTA、AFB1、展霉素、柑桔霉素、ZEN和DON(图2f)。结果表明，该探针对OTA具有良好的选择性，其响应强度比为其他真菌毒素的500倍左右。并对该传感器的抗干扰能力进行了评价。如图2g所示，在食物或环境复杂基质中可能存在的常见离子、糖和氨基酸对检测结果没有明显的干扰。
Fig. 3. Portable paper strips for OTA detection. (a) Construction and (b) daylight photographs of DOCE@ALB-loaded paper strips. (c) Fluorescence photographs and (d) blue-to-red (B/R) ratios in paper strips upon addition of OTA with increasing concentrations (0.3 – 5 μM). Photographs were excited by a handhold UV lamp (365 nm), then captured and analyzed by a smartphone application (Color Picker). Error bars = ± SD.
智能手机辅助荧光分析涉及捕获响应照片的RGB值，而不是使用商用荧光仪测量其荧光光谱。为了验证该传感器的便携性，根据我们之前的研究(图3a-3b)，将DOCE@ALB-loaded纸条方便地集成在一起。在紫外灯的激发下，纸条的荧光颜色呈现黄色。随着OTA浓度的增加，荧光颜色逐渐由黄色过渡到蓝色(图3c)。来自三个不同批次的条带的颜色反应保持高度一致。如图3d所示，蓝红比(B/R)与OTA浓度呈很强的线性相关(R2 = 0.98)，测试纸测得的LOD为32 nM(约12 ppb)。
Fig. 4. Analysis of flour samples. (a) The extraction process of flour samples. (b) Fluorescence spectra and (c) intensity ratio (I450/I575) of DOCE@ALB (1 μM) in the flour extracting solutions spiked with increasing concentration of OTA (0 – 1 μM). The blue line in (b) represents the autofluorescence of flour extracting solutions. Inset in (c): Photographs of DOCE@ALB in flour extracting solutions with different OTA concentrations (0, 0.1, 0.3, 0.5, and 1 μM) under a handheld UV lamp (365 nm). λex = 400 nm. Error bars = ± SD.
OTA是储藏谷物中常见的一种真菌毒素，当小麦处于温暖潮湿的条件下时，会造成很高的风险，促进小麦的真菌的生长。因此，面粉和面粉制品中OTA的检测至关重要。面粉样品的提取液经过溶解、涡旋、超声、离心、收集上清五个基本步骤得到(图4a)。如图4b-4c所示，DOCE@ALB对OTA表现出显著的比例荧光响应。强度比(I450/I575)与OTA浓度在0.01 ~ 0.3 μM范围内呈较强的线性相关(R2 = 0.99)。LOD为3.7 ppb，满足中国食品安全国家标准(5 ppb)的检测阈值。
真实样品分析——酒类
Fig. 5. Fluorescence spectra of DOCE@ALB (1 μM) with addition of increasing concentration of OTA (0 – 1 μM) in PBS (0.1 mM, pH ∼ 7.4) containing varying volume ratios of ethanol: (a) 5%, (b) 10%, (c) 15%, and (d) 20%. λ = 400 nm.
在一些谷物类酒精饮料中也经常发现OTA，如啤酒、白葡萄酒和红酒。最初的考虑集中在乙醇是否会影响DOCE@ALB的响应行为。如图5所示，在添加OTA后，DOCE@ALB在含有不同体积比乙醇的缓冲溶液中始终显示比例荧光响应，范围从5%到20%。该结果表明，测试溶液中乙醇含量仅影响DOCE@ALB在575 nm处的初始荧光强度，而不影响对OTA的基本响应模式。因此，在上述酒精含量范围内，DOCE@ALB能够进行OTA的比例检测。
Fig. 6. Analysis of beer samples. (a) 3D-printed testing device for the on-site detection of OTA in beer samples. (b) Fluorescence photographs of testing samples excited by a handhold UV lamp (365 nm), then captured and analyzed by a smartphone application (Color Picker). The first row: the autofluorescence of beer sample, DOCE@ALB (10 μM) in beer samples in the presence of increasing concentrations of OTA (0, 5, 20, 40, and 60 nM). The second row: DOCE@ALB (10 μM) in beer samples in the presence of other mycotoxins (60 nM), such as AFB1, patulin, citrinin, ZEN, and DON. (c) Blue-to-red ratio (B/R) of the testing samples. Error bars = ± SD.
在我们之前的研究的启发下，我们采用了一种便携、紧凑的检测设备对OTA进行现场检测(图6a)。测试装置以聚酰胺纤维为原料，采用3D打印技术制作而成。使用这种便携式测试设备，整个方法可以在均匀溶液中进行，并且可以通过智能手机直接读取荧光颜色信号。啤酒样品在测试前经过脱气和稀释十倍。如图6b所示，啤酒本身呈现蓝色的自身荧光，主要来源于多酚类或核黄素类化合物。在DOCE@ALB存在的情况下，发射颜色变为黄色。随后，随着啤酒中加标OTA浓度的增加，在5 - 60 nM范围内，发射颜色逐渐由黄色过渡到蓝色。其他可能与OTA共存的真菌毒素未导致放射色的任何区别性变化。通过使用智能手机收集RGB值(图6c)，可以根据蓝红比(B/R)对啤酒样品中的OTA浓度进行半量化。
Fig. 7. Analysis of wine samples. Filtration treatment and photographs of (a) white wine and (b) red wine samples by using DOCE@ALB to detect OTA. PMA: polyacrylamide. C and T represent the wine samples spiked with 0 μM and 30 μM of OTA, respectively. Photographs are captured by the smartphone under the excitation of a handhold UV lamp (365 nm). (c) Excitation-Emission matrix fluorescence (EEMF) of the untreated and treated white wine samples. (d) Blue-to-red ratio (B/R) of the testing samples. Error bars = ± SD.
此外，我们还评估了DOCE@ALB在白葡萄酒和红葡萄酒样品中的OTA测试能力。由于白葡萄酒中含有大量的发射性酚酸和多酚化合物，因此白葡萄酒本身呈现蓝色的自身荧光(C组)，与OTA非常相似(图7a)。加入OTA后，酒样的发射色基本保持不变(T组)。两组测试样品在荧光颜色方面无法区分。但是，当DOCE@ALB存在时，没有OTA的样品变成黄色，而加入OTA的样品变成白色，颜色的差异很容易用肉眼区分。而对于红酒(图7b)，极强的光吸收几乎掩盖了OTA和DOCE@ALB的荧光。因此，预处理是必要的。采用聚丙烯酰胺过滤柱去除红酒中的不水溶性物质和各种色素(花青素、槲皮素等)。经此处理后，红酒变成无色透明的液体，其固有荧光也明显减弱(图7c)。过滤后的白葡萄酒和红葡萄酒样品对OTA的信号响应都能有效增强(图7d)。通过比较荧光颜色的变化，利用DOCE@ALB作为传感器可以很容易地区分含OTA和不含OTA的处理样品。结果表明，DOCE@ALB是一种很有前景的分析工具，可用于葡萄酒样品中OTA的快速、现场定性检测。
小结
综上所述，本研究提出了一种新的现场检测食品和饮料样品中赭曲霉毒素A(OTA)的分析方法。基于指示剂置换法，我们开发了一种荧光超分子传感器DOCE@ALB，该传感器对OTA具有快速响应、高灵敏度和选择性。此外，DOCE@ALB纸基试纸条的开发进一步增强了OTA检测的便携性和便利性，成为现场应用的实用解决方案。3D打印测试设备的集成为面粉、啤酒、白葡萄酒和红酒等真实食品样品的定性和半定量OTA检测提供了一种用户友好的方法。与以前报道的方法相比，我们的方法在响应时间和便携性方面显示出显著的优势。这种传感器的现场检测潜力使其成为确保食品安全的有前途的分析工具，特别是在至关重要的情况下及时分析。
作者简介
张铭元 ，深圳大学2021级材料学院，材料科学与工程硕士研究生，研究方向为超分子荧光探针对环境和食品中各种有害物质的检测。目前，硕士在读期间以第一作者身份在 Journal of Hazardous Materials 期刊上发表SCI论文两篇。曾获国家奖学金，深圳大学一等、二等学业奖学金。
刘斌 ，深圳大学材料学院副教授，博士生导师。主要研究方向为荧光探针与医学诊断器件。获得深圳市海外高层次人才孔雀计划，深圳市后备人才，南山区领航人才，深圳大学荔园优青，斯坦福大学全球前2%科学家（2022，2023）。主持国家自然科学基金面上项目2项，青年项目1项，省、市级基金10余项；在Angew. Chem. Int. Ed., J. Am. Chem. Soc., ACS Central Science, Chemical Engineering Journal, Journal of Hazardous Materials, ACS sensors, Sensors and Actuators, ACS Appl. Mater. Interfaces, Food Chemistry等SCI期刊上发表论文80余篇，总被引次数超过3000次，H-index为32 。
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