科研 | 重庆大学（IF：10）：苯并[ a ]芘胁迫下土壤微生物群落的结构、代谢和功能特征

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编译：微科盟索亚，编辑：微科盟索亚、江舜尧。

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导读

了解土壤微生物对苯并[a]芘（BaP）的响应特征有助于加深对BaP对土壤生态系统风险的认识。在本研究中，我们研究了土壤微生物群落对BaP（8.11 mg kg ^-1 ）在结构、代谢和功能上的响应。基于16S rRNA和ITS基因测序的微生物群落结构分析表明， 添加BaP的土壤富集了与芳香族化合物降解相关的微生物（鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属、镰刀菌属）和寡营微生物（ Blastocatellaceae 、 Rokubacteriales ），但抑制了参与固氮过程的蓝细菌门 。网络分析表明， BaP胁迫下细菌群落增强了种内合作，而真菌群落主要是关键类群发生了改变 。Biolog生态板（ECO板）试验表明， BaP的添加对碳源（尤其是含氮源）的微生物代谢有促进作用 。基于酶活性测定、功能基因定量和功能注释的功能分析表明， 氮循环过程，尤其是固氮过程受到显著抑制 。这些结果表明，耐BaP微生物可能与敏感微生物建立合作关系，竞争资源和生态位，特别是与氮循环相关的微生物，最终导致碳源利用增强和氮循环受限。本研究较为明确地阐明了土壤微生物群落对对BaP污染的适应策略和功能转变。

亮点：

1.系统地揭示了土壤微生物群落对BaP胁迫的响应

2.降解芳香族化合物的微生物增多，可能与BaP敏感微生物竞争营养物质

3.土壤细菌群落在 BaP 胁迫下增强了种内合作

4.刺激了含氮的碳源微生物代谢

5.土壤氮元素循环过程受到抑制

论文ID

原 名： Structural, Metabolic, and Functional Characteristics of Soil Microbial Communities In Response to benzo[a]pyrene Stress

译 名 ： 苯并[ a ]芘胁迫下土壤微生物群落的结构、代谢和功能特征

期刊 ： Journal of Hazardous Materials

IF： 10.588

发表时间： 2022.03.05

通讯作 者： 张利兰

通讯作者单位： 重庆大学环境与生态学院

DOI号： 10.1016/j.jhazmat.2022.128632

实验设计

土壤采集于四川省长宁县农田的0到15厘米深的表层土壤，测定土壤理化性质。构建土壤微生态系统。设计三组试验：(1)添加BaP的土壤（BaP组），(2)仅添加等体积溶剂(无污染对照，CK组)的土壤，(3) 添加BaP至(简称非生物对照， s-BaP组)的高压灭菌处理土壤，所有处理一式三份。土壤湿度调整到田间饱和水容量的50%，并在整个培养过程中进行重量监测。分别于第0、1、3、7、15、30、60天采集土壤样品。对土壤样品进行BaP降解情况测定、16S rRNA和ITS微生物测序分析、Biolog生态板（ECO板）试验、土壤酶活及功能基因定量。探究苯并[a]芘(BaP)胁迫下土壤微生物群落的结构、代谢和功能特征。

结果与讨论

1 苯并[a]芘的降解动力学

苯并[a]芘（BaP）的有氧降解遵循二级动力学，如图1a所示，拟合为1/Ct= 1/C0+ 0.0021t， R ² = 0.963，半衰期计算为59天。BaP在前15天消散相对较快，降解百分比为24.89%，但随后减慢，在第60天消散了50.55%。相反，在非生物对照中，BaP浓度没有随着时间显著下降，说明土壤微生物在BaP降解中占据主导地位。BaP在土壤中的生物降解很大程度上取决于土壤原始微生物、土壤理化性质和BaP初始浓度，大多数研究表明BaP的半衰期在几十天到几百天之间。与我们之前的发现相比，BaP的复杂结构及其与土壤颗粒结合的趋势使其降解比低分子量多环芳烃（LMW-PAH）更具挑战性（半衰期：BaP59天与菲7天）。此外，环羟基化双加氧酶（RHD）参与多环芳烃降解的α亚基基因已被用作描述功能菌降解潜力的一项指标，尽管有许多其他未知基因或酶可能参与多环芳烃的降解，它们仅提供了有限的信息。分别对革兰氏阳性（GP）和革兰氏阴性（GN）细菌中编码RHD酶的RHD-GP和RHD-GN 基因进行量化分析。如图1b所示，与对照相比，添加BaP增加了RHD-GN基因的丰度，但降低了RHD-GP基因的丰度，这表明GN细菌可能对BaP降解的贡献更大，这与之前的研究结果一致。然而，也有一些研究表明，与RHD-GN相比，RHD-GP的丰富度更高，这可能是由于不同的实验条件或用于扩增RHD基因的引物设置的差异造成的。

_{图1. BaP的降解动力学及RHD-GN和RHD-GP基因丰度对BaP的对数转换响应比。}

2 微生物群落结构对BaP胁迫响应的特征

2.1 微生物群落多样性和组成

土壤微生物包括细菌和真菌是各种生物地球化学循环过程的主要驱动因子，研究其结构的变化有助于理解和解释BaP胁迫下生态环境的变化。QPCR结果显示，BaP的添加降低了真菌群落的丰富度，但对细菌群落的丰富度无显著影响（ p   > 0.05）（图S2）。在多样性方面，BaP对细菌群落的影响大于对真菌群落的影响，表现为BaP处理（ p <  0.05）的细菌丰富度显著高于对照（S7），均匀度显著低于对照（S7）。有研究表明，微生物丰富度的增加很可能是其面对污染物时群落发生的重组。微生物群落在门水平上的组成见图2。在细菌和真菌群落中分别鉴定出大约43个门和11个门。如图2a所示，所有样本中丰富的细菌门是变形菌门、酸杆菌门、放线菌门和绿弯曲菌门，它们共享超过 65% 的总序列。对于真菌群落（图2b），它以子囊菌门和被孢霉门为主，占CK和BaP组总序列的76.5-87.8%。总体而言，丰富门的相对丰度在处理之间没有表现出明显的差异。如图2a所示，所有样本中丰富度最高的细菌门是变形菌门、酸杆菌门、放线菌门和绿弯曲菌门，它们共享超过65%的序列。对于真菌群落（图2b），它以子囊菌门和被孢霉门为主，占CK和BaP组总序列的76.5-87.8%。总而言之，微生物菌门的相对丰度在处理之间没有表现出明显的差异。微生物在门水平上分为丰富（相对丰度 > 1% ）菌门和稀有（相对丰度 < 1 % ）菌门。稀有微生物物种通常与土壤生态系统的多种功能相关。因此，我们选择了稀有的细菌和真菌门，如图2C和2d所示。如图2c所示，在BaP处理下厚壁菌门的相对丰度显著增加（CK 0.2 -0.6 % vs BaP 0.4 - 1.2 %），而蓝细菌门的相对丰度显著下降（CK 0.4 -1.1 % vs BaP 0.12 - 0.29 %）。 Patescibacteria 在BaP胁迫下也受到抑制，特别是在第3天。厚壁菌门的许多成员可以耐受极端环境。蓝细菌门由于其固氮能力而在补充土壤氮元素过程中发挥重要作用。有研究表明，蓝细菌门与 nif H和 amo A基因呈正相关。在石油和菲污染的土壤中也观察到蓝细菌门的生长受到抑制。对于真菌（图2d）而言，与CK相比，BaP处理主要在第15天增加了 Olipdiomycota 和 Blastocladiomycota 的相对丰度。稀有物种比丰富菌门对BaP 胁迫更为敏感。

_{图2. 在门水平上细菌群落和真菌群落的相对丰度。}

_{图3. 基于线性判别分析效应大小（LEfSe），CK和BaP处理之间存在显著差异的细菌和真菌进化分支图。}

为鉴定在BaP胁迫下细菌和真菌的响应，我们进行LEfSe分析（图3）。共有88个细菌和11个真菌的进化分枝表现出显著差异（LDA> 2.0）。在CK样品中，11个蓝细菌门的成员表现出丰富度的优势，而在BaP污染的土壤中富集了一些属于厚壁菌门、Methylomirabilota门和粘菌门的微生物。BaP处理中的生物标记物应该对BaP污染的环境具有耐受性。厚壁菌门中许多属于芽孢杆菌纲的物种被确定为PAHs的降解菌，在被BaP污染的堆肥土壤中也发现了其的丰富度变化。受到BaP胁迫的影响，Rokubacteriales和芽单胞菌门是生长缓慢的寡营微生物，它们更喜欢低营养条件的环境。前人的研究表明，多环芳烃（主要是LMW-PAHs）的输入可以导致了多营养细菌的积极发育。与LMW-PAH不同，BaP的降解需要消耗共代谢底物，并且在本研究中添加的相对低剂量BaP可能无法为降解细菌提供营养丰富的环境。真菌响应BaP的胁迫数量少于细菌，CK组有6个分类群，包括 Onygenales 、 Arachnomycetaceae 、 Polyporals ，而BaP处理中存在5个分类群，包括 Agaricaceae 、 Glomerellales 、 Cystofilobasidiales 。其中， Onygenales 已经被证实具有产生 N ₂ O 的能力，表明在BaP胁迫下土壤养分循环可能会受到干扰。

2.2 微生物群落的网络关系

微生物网络分析——广泛应用于微生物生态学研究中，可以用来揭示与决定土壤健康或特定功能相关的微生物共现模式。在本研究中，我们构建了微生物共现网络，帮助我们了解BaP对微生物种内和种间生态关系的影响，并识别关键物种。在细菌网络（图 4a，b）中，边的数量从CK的1186减少到BaP处理的946，而正相关的比例从57.34%增加到71.46%。与CK相比，BaP处理形成了更大的共现网络，模块化程度更高（表S3），表明BaP胁迫下更具有组织结构。具有高点度中心性和低中介中心性的物种通常被理解为关键类群。对照组的关键类群为类固醇杆菌科、 Anaerolineae 和 Terrimonas ，而在BaP处理中，关键类群转变为黄杆菌科和芽单胞菌科。在菲污染土壤中，黄色杆菌科在细菌网络中同样具有优势地位，这表明黄色杆菌科在多环芳烃胁迫下的微生物群落中具有潜在的领导作用。芽单胞菌科是生长缓慢的寡营微生物，能够适应贫瘠的底物环境。这两个以类群为关键微生物的模块中，微生物之间大多数连接都是正的，并且这些连接的类群主要与芳香烃降解有关，例如 Gemmatimonas 、 Labrys 、 Pseudonocardia 和Agromyce。值得注意的是，一些更喜欢贫瘠养环境的微生物参与其中，如关键微生物芽单胞菌科和 Blastocatellaceae 。这些寡营微生物能够更有效地利用有限的资源维持生命过程。能够降解PAHs的微生物属与寡营微生物之间的正相关网络可能是适应BaP污染环境的营养策略。 在真菌网络中（图4c，d），连接数从CK的371个减少到BaP处理的358个，正相关性降低（CK为55.26%，BaP 为 51.12%）。在CK中，属于子囊菌门的 Scytalidium 和 Scolecobasidium 占据了两个最大的模块。相比之下，BaP处理中的真菌网络以Conocybe和壶菌门为主，并且与 Emericellopsis 、 Cercophora 和 Chaetothyriales 共现。 Conocybe 和 Chytridiomycota 都可以促进纤维素水解，因此它们之间的负相关关系可能是由于对底物的竞争。

此外，我们分析了土壤细菌和真菌的共现模式，以阐明BaP胁迫下微生物种间相关性的变化。细菌与细菌、真菌与真菌、细菌与真菌之间的正链接数及其占总连接数的比例见表S4。总连接从CK的573个增加到BaP处理的640个，主要是由于细菌-真菌之间的连接增加（CK 117 vs. BaP 169）。而且大多数增加的细菌-真菌关系都是正相关的，这表明细菌-真菌合作的加强是对BaP的反应策略。前人的研究表明，PAHs在真菌酶的作用下可以形成亲水性中间体，促进PAHs在细菌中的进一步转化。因此，细菌和真菌之间的协同作用可能有助于PAHs的降解，从而缓解PAHs的胁迫，这在木质素和苯并[a]蒽的共代谢中也有发现。这些结论是基于ASVs的相关性分析得出的，这些相互作用与PAHs降解之间的关系还有待于进一步研究。总体而言，细菌群落对BaP的敏感性高于真菌群落，细菌多样性指数变化显著并且对BaP胁迫的响应更多。BaP污染促进了PAHs降解微生物的生长，在PAHs污染的环境中普遍存在。然而，一些参与氮循环的物种受到了不良影响。在BaP胁迫下，细菌群落种内合作加强，以促进养分的利用。相比之下，真菌网络相对稳定，主要是关键物种被改变。进一步的细菌-真菌网络分析表明，加强种间合作而非种间竞争是微生物群落应对BaP污染的策略。

_{图4. 细菌和真菌群落的共现网络图。}

3 微生物群落代 谢对BaP胁迫响应的特征

为了阐明微生物代谢对BaP添加的响应，我们在第60天进行biolog生态板试验，以表征微生物群落（可培养与不可培养）对碳源的代谢指纹。微平板每孔颜色平均变化率（average well color development，AWCD）反映了微生物利用碳源的总体活性。如图5a所示，BaP处理的土壤在整个培养过程中表现出较高的AWCD值，表明其微生物代谢加快以满足生理需要。碳源代谢的强度一般与相应微生物的数量、代谢能力和多样性成正比。添加BaP（ p  >  0.05）对香农多样性指数和辛普森多样性指数没有显著影响，但显著提高了表征碳源代谢均匀性的McIntosh指数（ p < 0.01）。前人的研究表明，均匀度促进了自然微生物群落对外界污染的快速反应，而不是群落丰富度。我们的结果表明，碳源利用的均质化可能有助于抵御BaP污染。为了进一步探究BaP如何改变土壤微生物的代谢模式，计算了六种不同类别底物（碳水化合物、羧酸、氨基酸、多聚体、酚类化合物和胺）的AWCD值，如图5b所示。BaP的加入促进了胺类和多聚体的利用率，但抑制了酚类化合物的利用率。胺类和多聚体的AWCD值增加表明，BaP处理的微生物在生长和繁殖过程中对这两种底物有更高的要求。具体而言，与对照相比，BaP处理主要促进γ-羟基丁酸、L-天冬酰胺、糖原、α-环糊精、吐温80和腐胺的利用，而抑制α-酮丁酸、衣康酸和4 - 对羟基苯甲酸的利用（图5c）。

前人的研究发现，PAHs降解者的加入会导致碳源代谢显著增强，这些降解者通常需要共同代谢来消耗BaP。有研究表明，一些在BaP处理中可以刺激利用的碳源有利于多环芳烃的降解，如吐温80和吐温40。此外，L-天冬酰胺和腐胺是可作为氮源的含氮碳源，它们的利用率升高可以反映微生物群落对氮的需求。对于代谢而言，微生物群落加速了碳源的代谢以满足其生理需求，这可能是由于碳氢化合物降解者数量的增加造成的，表明了微生物群落结构可能会影响代谢需求。此外，BaP处理的土壤中对含氮碳源的更高消耗和需求反映了潜在的无机氮缺乏。当然，Biolog生态板试验也存在局限性，因为它只能检测代谢活跃和需氧的细菌，并且只能提供少量与生态相关的碳源。

_{图5. CK和BaP处理微生物群落的代谢情况。}

4 微生物群落功能对BaP胁迫响应的特征

微生物群落具有的多种功能驱动着土壤生物地球化学循环。在本研究中，我们将酶活性、功能基因qPCR和基于扩增子测序的微生物功能预测结合起来，有助于了解土壤微生物功能尤其是氮素循环对BaP胁迫的响应。FAPROTAX基于原核微生物分类数据库的功能注释，主要适用于预测生物地球化学循环过程。基于FAPROTAX的预测结果，碳氮循环功能变化如图S4所示。其中，与对照相比，BaP处理的固氮、好氧氨氧化和硝酸盐还原强度受到了一定的抑制，而芳香族化合物降解和几丁质降解功能则得到了促进。前期的研究也发现芳香族化合物降解和几丁质降解同时增强，这可能是由于同时具有两种功能的微生物（如芽孢杆菌属）的丰度增加所造成的。为了进一步研究土壤氮循环过程对BaP胁迫的响应，我们在整个培养过程中的特定时间点评估关键酶活性和功能基因丰度。结果如图6a所示，与对照相比，BaP处理中的AMO活性受到抑制，抑制程度在第7天达到最大值。AMO催化的将 NO ₃ ^- 转化为 NO ₂ ^- 的氨氧化过程是硝化的限制步骤。分别跟踪代表氨氧化细菌和古细菌的AOB amo A和AOA amo A基因。如图6d所示，BaP的添加在第15天显著（ p  < 0.05）降低了AOB amo A的丰度，并在第30天和第60天抑制了AOA amo A基因，这表明氨氧化细菌和古细菌在不同的时间阶段受到干扰。这些时间效应可能是由于BaP往往不是作为单一物质存在于土壤中，并且总是伴随着其他多环芳烃衍生物，这也可能影响微生物的活性。

我们之前的研究结果还表明氨氧化过程对菲污染很敏感。NAR和NIR酶负责 NO ₃ ^- 和 NO ₂ ^- 反硝化。NAR的活性如图6b，在第7、30和60天观察到显著的抑制作用（ p  < 0.05）。在第15天和第60天，BaP处理中的NIR活性显著（ p  < 0.05）低于对照（图 6c）。我们还分析了分别编码 NO ₃ ^- 和 NO ₂ ^- 反硝化细菌的基因 nar G和 nir S。如图6d所示，在BaP处理的第30天和第60天， nar G受到显著抑制，而 nir S没有受到显著影响。这些结果证明了BaP暴露对土壤反硝化的不良影响。前人的研究表明，在厌氧条件下用硝酸盐和亚硝酸盐作为电子受体降解LMW-PAH。然而，在本研究的好氧环境中，厌氧反硝化细菌可能处于劣势。此外，编码固氮的 nif H基因在BaP处理中显著降低（ p  < 0.05）。结合上述分析表明，BaP对固氮功能的不良影响可能是由于蓝细菌门的相对丰度显著下降。对于微生物群落的功能响应，基于酶活性和功能基因的分析，BaP胁迫促进了一些与碳循环相关的功能，如芳香族化合物降解和几丁质降解，但是抑制了氮循环过程。

_{图6. 土壤氮循环酶活性和功能基因丰富度对BaP的响应。}

5 微生物群落和功能之间的关系

对在属水平上的细菌和功能基因的共生模式进行了研究，探讨了它们之间可能的关系。两个处理的数据被用来构建网络，具有正相关关系如图7所示。在网络图中，RHD-GP基因具有最高的度（节点细菌属数量），与诺卡菌属、纤维微杆菌属、 Candidimonas 属等16个属呈正相关。其中，诺卡菌属和 Candidimonas 也与 nif H和 amo A基因相关。前人的研究表明，诺卡菌属的物种具有巨大的LMW-PAHs生物修复潜力。但在本研究中，它在土壤中被BaP的添加所抑制，者可能是由于来自其他耐BaP微生物的竞争造成的。RHD-GN基因与细胞弧菌科、 Crocinitomicaceae 科、链霉菌科、 Gracilibacteria 科呈正相关。其中，细胞弧菌科因其降解复杂碳水化合物的能力可以在缺乏营养的生态位中被发现。链霉菌科可以降解多种有毒有机污染物，包括二嗪农、氯丹和氨基甲酸酯。这些结果表明，能够耐受营养贫瘠和恶劣条件的微生物可能在受BaP污染的土壤中拥有更多的生存机会。此外，与氮循环功能基因相关的物种大多是稀有物种，表明它们可能在调节养分循环和抵抗外界胁迫方面发挥重要作用。

_{图7.细菌类群与靶向功能基因的共现网络。}

结论

在本研究中，旨在尽可能全面地揭示微生物对BaP胁迫的响应。首先，分析BaP的生物降解情况，以提供土壤微生物组的真实暴露浓度，该浓度比只提供初始浓度更接近真实环境条件。随后，对基于16S rRNA和ITS基因qPCR的细菌和真菌丰富度进行分析，以评估细菌和真菌丰富度对BaP胁迫的整体响应。在此基础上进一步分析了两个基因序列的生物多样性和组成，揭示了特定类群的变化。基于上述分类数据的网络分析，揭示了种间和种内关系。最后，根据功能分类群变化结果进一步测定相关功能活性，以验证与土壤功能密切相关的微生物群落结构的变化。总的来说，面对BaP胁迫，稀有物种比丰富物种更敏感。本研究中耐BaP的菌门是厚壁菌门、甲基菌门、粘球菌门、Olipdiomycota门和芽枝霉门，其相对丰富度增加。细菌群落增强了与真菌群落的种内和种间合作，以应对BaP胁迫。在代谢方面，土壤微生物加速了外源碳源，特别是含氮碳源的代谢，以满足其在BaP胁迫下的生理需求。功能分析表明，氮循环相关过程受到不良影响，尤其是固氮作用，这可能是由于相应微生物的相对丰富度降低造成的。综上，本研究有助于了解BaP胁迫对土壤微生物群落的影响，特别是在碳源代谢和氮循环过程方面。但BaP进入土壤后会发生复杂的生物转化并产生多种衍生物，这些降解产物对土壤微生态的影响有待进一步研究。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389422004216#!

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