【收藏】五分钟了解大分子分析利器——体积排阻（SEC）色谱
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随着生物制药的迅猛发展，越来越多的生物制药/生物技术公司如雨后春笋般应运而生，越来越多的同学从小分子色谱分析“转行”到 大分子色谱分析 ，其中不少同学有些不适应也有些困惑。
因此大师兄团队尝试着分享一些第一手的经验，希望能够帮到同学们。也希望同学们踊跃发言提问与交流，大家共同提高。
相对于小分子药物，抗体/蛋白类药物 分子量大、活性基团多、稳定性低，且容易产生结构复杂且相近的 变体 ，其质量控制的要求远高于小分子药物。
如何全面表征抗体药物的关键质量属性，成为抗体药物开发的关键点和难点。
目前表征的主要项目和对应的分离模式如下：
体积排阻（SEC）
这次咱们就先聊聊生物大分子色谱分析中最常用的分离模式： 体积排阻（SEC）
体积排阻色谱（SEC）是广泛应用于生物制药中单抗聚体及片段检测的一种重要分析手段。
体积排阻色谱是一种非保留分离模式，其分离原理是根据物质大小尺寸来分离（对于同类物质，也可以说根据分子量来分离）：
● 高分子量组分无法进入固定相孔道，最先流出；
● 中等分子量组分可以进入部分固定相孔道，随后流出；
● 低分子量组分可以进入所有孔道，最后流出。
分离机理这么简单，那使用起来岂不是小菜一碟？非也！
下面来看看在使用SEC色谱柱时常常遇到的问题：
问题一：为什么SEC色谱柱那么容易塌呢
有经验的同学们都知道SEC色谱柱比较“ 敏感脆弱 ”，使用中一不留神就可能造成柱床塌陷而不能使用。可为什么呢？
SEC的分离原理基于不同大小的组分流经的填料中孔道路径差异， 因此SEC填料需要较大孔容积来确保分离效果。
孔容积越大，有效“分离窗口”越宽，分离效果就越好。然而填料的孔容积越大，机械强度就越差 ，因此所装填的SEC色谱柱的耐压性比常规的C18色谱柱要差不少。
所以在使用SEC色谱柱时，需要注意 流速的设置 ，另外建议 逐步缓慢提升至实验流速 ，降低色谱柱由于升压过快导致柱床塌陷的风险。
这里有一个好消息：由于微球材料技术的发展，我国的科学家已经研制出新一代的SEC微球材料并实现了商品化，在保证分离效果的同时，大大地提高了填料的耐压性，延长了色谱柱的使用寿命。
详情请见: http://www.nanochrom.com/products_18/79.html
问题二：为什么在启用新柱时有时会出现出峰不稳定的情况？
当启用一支新的SEC色谱柱时，有时会出现第一针峰值相应很低，随着不断进样信号相应逐渐提高最后趋于稳定。
这是在生物大分子色谱分析中经常遇到的情况，其原因是色谱柱筛板、柱管和填料存在一定数量的 活性位点 ，而这些活性位点会吸附某些特定性质的生物大分子。
例如在单抗聚体分析中，刚开始有时会出现聚体峰面积逐步增大的现象；待所有未知活性位点被蛋白完全屏蔽后，样品中所有组分峰面积就会稳定下来。
因此，在开启一根全新的SEC色谱柱时，建议先注射足量的抗体/蛋白样品来屏蔽活性位点，再进行正常的样品分析，会得到稳定重现的分析结果，该过程是为 色谱柱“钝化” 。
何为足量的样品呢？
200μg左右的抗体/蛋白类样品（浓度10mg/mL左右，进样量20μL） 一般可以屏蔽所有活性位点；如有不足，可以再来一针。
好了今天的讲解就到这里，下一集我们再来讲讲 SEC柱流动相的秘密 ，敬请期待！
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