科研 | Environ. Microbiol.：土壤细菌对化学性质不同底物的系统发育组织具有同化作用

不同基质之间添加碳的矿化作用在存在差异（图1），但在第7天和第21天，凋落物处理对添加碳的矿化影响不显著（双向方差分析）: 基质，F _3,24  = 145.0, p  < 0.01；凋落物处理，F _2,24  = 2.8, p  = 0.08；交互作用，F _6,24  = 1.4, p  = 0.27），第21天（底物，F _3,24  = 69.1, p  < 0.01；凋落物处理，F _2,24  = 2.9, p  = 0.08；交互作用F _6,24  = 0.9, p  = 0.27）。氨基酸和葡萄糖也遵循类似的模式，约25%的添加基质碳在第一周被矿化，只有少量的额外量（<4%）在第7天到21天之间被矿化。培养初期脂质分解速度较快，但累积碳矿化量较低，仅占21 d后添加碳底物的3%左右。随着时间的推移，纤维素的分解更加稳定，约3%的碳在7天后矿化，约13%在21天后矿化。根据碳矿化动力学，对第21天采集的纤维素和第7天采集的其他基质的土壤样品进行了分子分析（更多细节请参见文章“材料与方法”部分）。

图1 第7天和21天添加到来自对照组C、双凋落物D和无凋落物N处理组土壤中的富含 ¹³ C基质的累积碳矿化数值（平均值±标准差）。

微生物群落（图S1）以变形菌门 Proteobacteria （序列数占16S rRNA基因序列的29%-49%）和酸杆菌门 Acidobacteria （25%-40%）为主，此外疣微菌门 Verrucomicrobia （~8%）、浮霉菌门 Planctomycetes （~6%）、放线菌门 Actinobacteria （~3%）、拟杆菌门 Bacteroidetes （~3%）、 AD3 菌（~3%）、绿弯菌门 Chloroflexi （~2%）和厚壁菌门 Firmicutes （~1.4%）也占有一定比例。 微生物群落组成对凋落物处理和基质变化的响应不大 （图2A；置换多变量方差分析（PerMANOVA）: 底物，pF _4,30  = 3.4, R ²  = 0.23, p  < 0.01; 凋落物处理pF _2,30  = 4.7, R ²  = 0.16, p  < 0.01; 交互作用pF _8,30  = 0.6, R ²  = 0.08, p  > 0.99）。少数细菌科的相对丰度在不同凋落物处理间存在差异（表S2）；例如，双凋落物中酸杆菌科相对丰度升高，无凋落物中杆菌科和鞘单胞菌科相对丰度升高，对照中慢生根瘤菌科相对丰度升高。几个科的相对丰度随着底物的添加而发生变化（表S2），最显著的是蛭弧菌科、伯克霍尔德菌科和微球菌科的相对丰度随着葡萄糖的添加而增加大约2 - 5倍，随着氨基酸的添加而增加大约4-15倍。纤维素使柄杆菌科和噬纤维菌科的相对丰度增加了2 ~3倍，脂类使莫拉氏菌科的相对丰度增加了3倍。

图2 利用Bray-Curtis相异性评价基质添加和凋落物处理对细菌群落组成（A）和相对碳同化率（B）的影响。培养前（T ₀ ）和培养1周（T ₇ ）添加底物时，对所有底物进行群落组成计算，纤维素在培养3周（T ₂₁ ）后进行分析。

类似于矿化结果（图1），凋落物处理没有影响所添加基质相对碳同化率的整体模式（采用qSIP技术测定），但在所添加的基质之间存在显著差异（图2B，PerMANOVA:基质, pF _{3, 22}  = 9.6, R ²  = 0.49, p  < 0.01;凋落物处理，pF _2,22  = 1.0, R ²  = 0.03, p  = 0.38；相互作用，pF _6,22  = 0.9, R ²  = 0.10, p  = 0.53）。氨基酸的平均相对碳同化率（图S2）最大，为0.109（每7天），其次是葡萄糖:0.053（每7天），纤维素:0.037（每7天）和脂类:0.027（每7天）。氨基酸是最广泛使用的底物，有402种（77%）观察到的同化底物的系统发育类型（图3A）。葡萄糖也被大量系统发育类型同化（176,33%），而吸收纤维素（68,13%）和脂类（37,7%）的系统发育类型相对较少。

添加4种底物的细菌相对碳同化率均表现出具有统计学意义的系统发育信号（Pagel’s λ， p <0.05）；然而，这些信号的强度在不同的基质上有所不同（图3C，表S3）。根据Pagel等人提出的λ评估， 系统发育信号在0到1之间变化，强信号（接近1）表明性状值在相关物种间的数量分布与布朗运动进化模型下的预期相似。 较低的特征值表明系统发育保守性较弱，且系统发育种的特征值分布更为随机。氨基酸和脂质的相对碳同化率的信号最强，而纤维素的信号明显较弱，葡萄糖的信号居中。当考虑底物在系统发育分支内碳同化的保存程度时，系统发育信号出现了类似的模式（图3B，表S3）。氨基酸的相对碳同化率最大，其次是脂质、葡萄糖和纤维素。

为了确定哪些分类群对基质的碳同化影响最大，本研究根据分类群的相对丰度和相对碳同化率估算了不同细菌科吸收碳的比例（图4）。与我们对系统类型的分析一致（图3A），相对于纤维素和脂质，更多的细菌科对氨基酸和葡萄糖的同化很重要。对于每种基质，一个科吸收了超过25%的添加碳，伯克霍尔德科吸收了氨基酸和葡萄糖，噬细胞菌科吸收了纤维素，草酸杆菌科吸收了脂质。

为了进一步描述这些性状的系统发育组织，我们估算了每种底物的相对碳同化率的祖先特征性状（图5）。这一分析强调了 能够轻易同化每一种基质的分支，这是通过共同祖先相对碳同化率的提高来反映。 例如， Betaproteobacteria 最近的共同祖先的氨基酸相对碳同化率（每7天）为0.315，远高于群落平均水平（0.109）。类似地，食胞菌科最新共同祖先的估计值比纤维素同化的群落平均值高约6.5倍。

图4 吸收底物并占总吸收的至少1%细菌科基质衍生碳同化平均值±标准差。颜色表示各细菌科的相对丰度大小和相对碳同化比率。

图5 系统发育树展示了氨基酸（A）、葡萄糖（B）、纤维素（C）和脂类（D）的相对碳同化速率。不同的颜色表示观察到的顶端类群和计算的祖先特征状态节点的速率，注意不同的时间尺度。

细菌功能特性中的系统发育组织有助于解决微生物组的巨大多样性，并更好地将群落组成与微生物介导的生态系统过程（如分解过程）中的功能联系起来。在本研究中，我们观察了土壤中不同化学基质的细菌的相对碳同化率的系统发育组织。采用长期森林试验的土壤，我们发现凋落物输入对基质同化没有影响。相比之下，在实验性的添加到土壤中的基质之间，和在同化微生物类群的数量和多样性以及系统发育组织的强度方面，存在显著差异。

尽管经过了超过25年的处理，凋落物处理组仅对土壤特征（表S1）和细菌多样性（图2A）造成轻微变化。同时，未观察到对基质同化（图2B）或矿化（图1）的显著影响。这些发现与其他研究相矛盾，这些研究表明， 历史上的凋落物输入可以影响微生物群落组成以及对当前输入的反应。 凋落物组成的差异（例如松木凋落物与阔叶木凋落物）对于确定微生物数量尤其重要。虽然森林土壤实验改变了凋落物的数量，但组成基本上没有变化，这可能解释了本研究中微生物对凋落物处理的不明显差异。该结果与其他森林土壤实验的研究一致，先前的研究表明， 添加20年凋落物对土壤总碳含量或矿层的轻组分碳没有显著影响。 类似地，Wang等人在泥土森林中的研究发现，在凋落物处理过程中，矿质土壤中植物碳生物标记物的浓度没有显著差异，这表明地上凋落物输入对土壤有机质OM的组成和微生物生物量的影响较小。综上所述，本研究的结果表明， 土壤细菌可能对凋落物输入的变化具有抵抗力，这可能是由于Georgiou等人所述的群落水平调节过程，或依赖于根源性输入。 最近的几项研究表明，根源碳输入可能是土壤碳储存和微生物功能的关键驱动因素，尤其是对细菌而言。

我们观察到不同基质间矿化和土壤细菌同化方面存在很大差异。与我们的预期一致，氨基酸和葡萄糖被一系列不同的微生物系统发育类型迅速矿化同化，而纤维素和脂质的矿化较慢（图1），被相对较少的细菌系统发育类型同化（图3-5）。在所有基质中，细菌对氨基酸的使用最为广泛（图3A），并且具有最高的相对碳同化率（图S2），这表明氨基酸是土壤细菌最喜欢的基质，比葡萄糖更容易用于生物量生产。这与过去的SIP研究结果一致，包括在水生系统中，多种浮游细菌的氨基酸中比从葡萄糖中更富含 ¹³ C。这也与森林土壤的实验一致，在该实验中，研究了蛋白质、脂类和多糖分解过程中微生物群落的演替。

细菌的相对碳同化率呈现出四种底物的系统发育信号；然而，与葡萄糖和纤维素相比，氨基酸和脂质的碳同化受进化史的影响更大（图3）。这与Goldfarb等人的研究结果一致，该研究报道了活性生物体在添加不稳定碳（即蔗糖、甘氨酸）而非纤维素后的系统发育聚类。然而，这些趋势与我们的假设相反，即葡萄糖和氨基酸的同化比纤维素和脂质具有更弱的系统发育组织；似乎与特征基因组复杂性驱动特征保守性的假设相冲突。然而， 在自然群落中，除了直接参与底物分解代谢的基因和相关表型外，特定底物可能涉及整套基因和相关表型。 这些潜在驱动因素的垂直遗传程度可能会影响观察到的系统发育组织。例如，噬纤维菌科具有滑动运动性，这可能使它们能够接触不溶性纤维素，并在本研究（图5）和其他研究中有效吸收这种碳源。对于高生物利用度和广泛利用的底物，如氨基酸和葡萄糖，竞争成功的决定因素是底物亲和力和生长速率，可能是同化过程的驱动模式。事实上，葡萄糖同化率与土壤群落的生长率密切相关。在不同的资源条件下，生长率的遗传决定因素是复杂的，并可能支持过去研究中观察到的生长率系统发育组织，以及在当前研究中观察到的氨基酸和葡萄糖同化率的系统发育组织（图3）。

为了将微生物的特性与其在生态系统中的功能联系起来，我们成功地确定了对处理土壤有机质中存在的基质非常重要的细菌家族（图4）。许多对氨基酸碳同化有影响的家族对葡萄糖碳同化也有影响。最值得注意的是，伯克霍尔德菌科有较高的相对碳同化率，随葡萄糖和氨基酸相对丰度的增加而增加，其所同化的碳约占氨基酸和葡萄糖碳同化的三分之一。除了伯克霍尔德菌科，伯克霍尔德菌科的另外两个科， Comamonadacea 和 Oxalobac teraceae 是同化葡萄糖和氨基酸的重要细菌。伯克霍尔德菌科包含了跟多植物和真菌共生体。类似地， Comamonadaceae 和草酸杆菌科的成员与土壤根际作用有关，包含了一些促进植物生长的细菌。因此，这些家族的成员可能已经适应了对根系分泌物竞争和同化，如葡萄糖和氨基酸。伯克霍尔德氏菌科可能具有一定竞争力，因为它具有多复制子基因组，进而使其具有高增长率。其他几个科对这两种基质都很重要（如华杆菌科、 Pse Udomonadace 和酸杆菌科），其中一些细菌的相对丰度也随着氨基酸和葡萄糖（微球菌科和蛭弧菌科）含量的增加而增加。然而，一些家族对氨基酸（如 Koribacteraceae 和 Usophaececeraceae ）的作用是独特的，而其他家族对葡萄糖的作用是独特的（例如放线菌目中未分类的细菌科和 Ellin329 ）。

从纤维素和脂类中吸收的碳大部分集中在几个细菌科中。这些脂质主要被 β 变形菌（草杆菌科和 Comamonadaceae ）和γ变形菌（ Moraxeleceae 和 Pseudomonada ）所同化。添加脂质后，莫拉氏菌科的相对丰度增加。研究发现，这些家族的成员在土壤碳氢化合物降解时相对丰度有所增加。事实上，添加脂肪酸可以在纯培养实验中模拟一些莫拉氏菌的生长。脂肪酸降解通过β氧化发生，需要多种基因和酶。在γ变形菌中，脂肪酸的β氧化过程用于能量或磷脂的合成。这种磷脂合成的节能适应性在革兰氏阳性细菌中不存在，在本研究中，可能有益于莫拉氏菌科的成员。草酸杆菌科和 Comamonadaceae 中的大多数成员都是运动的，这可能使它们能够获得低溶解度的脂质。我们的结果表明， 与脂质生长相关的性状表现出强大的系统发育组织 （图3B，C）。就纤维素而言，噬纤维菌科是最具影响力的菌群，占碳同化的近40%，其次是其他科，包括鞘氨杆菌科、鞘脂杆菌科、柄杆菌科和 Comamonadacea 。其中两个科，噬纤维菌科和鞘脂杆菌科在添加纤维素后相对丰度有所增加。这些家族的成员是已知的纤维素降解物，并在过去的土壤 ¹³ C标记的纤维素SIP试验中得到了验证。然而，这些细菌的纤维素分解机制却不同。噬纤维菌科有新的纤维素消化酶，它们与膜结合，这不同于将纤维素酶和木聚糖酶分泌到溶液中的 Comamonadacea 科成员。这些不同的机制可以反映趋同进化，解释观察到的纤维素同化相对较弱的系统发育组织（图3B，C）。

正如所有基于SIP技术的微生物功能研究一样，同位素转换是有潜力的，其中， 生物体DNA不是通过直接同化添加的 ¹³ C底物，而是通过摄取由富含 ¹³ C的底物的直接同化物产生的化合物（例如代谢物、坏死物质、胞外分泌物等）来进行同位素标记。 鉴于我们确定的许多分类群对每种基质都很重要，与过去的研究一致，大多数确定的分类群可能是基质的直接同化物。然而，一些细菌科可能通过同位素转换被贴上标签，至少部分是这样。已知含有运动专性捕食细菌的噬菌弧菌亚科和蛭弧菌亚科在多种基质中具有较高的相对碳同化率（图4）。在基于qSIP的实验中，捕食性细菌往往表现出比非捕食性细菌更高的同位素富集水平。这表明这些群体（蛭弧菌和类似生物： BALOs ）可能更喜欢积极的捕食性增长，在这种情况下，捕食者会利用添加的基质进行生物量生产。虽然证据有限，但 BALOs 的生态过程似乎与其系统发育密切相关，这表明这些群体的特征可能特别适合基于系统发育的预测。

我们的结果表明， 可以估计与分解作用相关的重要微生物性状的祖先特征状态 （图5）。这为基于系统发育的预测（也称为系统发育建模）奠定了基础，使用祖先特征估计来预测相关微生物物种未观察到的特征值。对于大型有机体，该方法可靠地预测了许多不同的特征，例如即使在群落中具有未观察到的特征的分类群占多数的情况下，食肉动物的体重和寿命以及鱼类的营养成分依然可被预测。在大型生物中，系统发育模型的实际应用还包括从通常观察到的近亲预测非常稀有、濒危两栖动物的特征，以及预测整个生态系统中木本植物对草食性动物破坏的易感性。利用系统发育关系预测微生物特征的一个挑战是水平基因迁移。然而，绝大多数微生物基因是垂直转移的。进一步分析原核生物的基因组和表型特征（在纯培养中评估）发现，98%的二元特征和74%的连续特征具有显著的系统发育组织。迄今为止，微生物特征的祖先重建仅限于使用基因组参考数据库来估计基因拷贝数。我们的方法大大扩展了祖先特征分析的潜在应用范围，使我们能够超越代表功能潜力的遗传特征，并利用表型功能特征的原位定量测量。这对于预测土壤中细菌的功能特性尤其有用， 因为土壤中细菌的高度多样性，再加上原位测量功能特性的方法学挑战，使得对大多数微生物类群的特性进行编码变得不可行。 相比之下，基于系统发育标记的生物多样性调查既便宜又常见。需要进行更多的研究，以确定这些调查是否可以与基于系统发育的预测相结合，从而为基于特征的生态系统功能模型提供信息。由于本研究利用了一组有限的纯基质，不包括土壤中有机质的多样性，因此这项工作应被视为理解土壤有机质分解的系统发育控制的第一步。

土壤中含有各种各样的有机基质和微生物种类，这两种物质都导致了土壤有机质分解的复杂性。本研究结果表明， 自然群落中的微生物在同化底物时具有系统发育组织。 具体而言，对于许多细菌系统发育类型（氨基酸和葡萄糖）使用的快速矿化基质，以及更受限制的细菌群（纤维素和脂质）使用的逐渐分解的化合物，都观察到了系统发育信号。利用微生物基质同化中的系统发育组织可以帮助我们解决土壤有机质分解的复杂生物控制问题，以便更好地理解和预测变化世界中的碳通量。