Nature Communications|N-
丙烯酰吲哚烷基（
NAIA
）能够通过化学蛋白质组学对新的可连接半胱氨酸和氧化硫醇进行成像和分析
大家好，今天推送一篇
2023
年
6
月发表在
Nature Communications
的文章“
N-Acryloylindole-alkyne (NAIA) enables imaging and profiling new
ligandable cysteines and oxidized thiols by chemoproteomics
”。文章的通讯作者是来自香港大学生物医学院的
Clive Yik-Sham Chung
教授。
半胱氨酸基于其固有的高亲核性和对氧化的敏感性。使得它可以控制和调节各种重要的生物过程。基于活性的蛋白质图谱（
ABPP
）已被证明是功能性半胱氨酸全蛋白质组图谱的强大平台。有趣的是在
ABPP
实验中，许多由基于活性的探针连接的半胱氨酸被发现与疾病的发展和繁殖有关。这有助于进一步研究使用以丙烯酰胺和氯乙酰胺连接的亲电试剂靶向新的可连接热点进行治疗。因此，基于活性的探针是重要的，可以帮助识别新的药物热点和新的治疗共价配体。
其中碘代乙酰胺炔烃（
IAA
）这种基于活性的半胱氨酸探针是目前用于全蛋白质组半胱氨酸分析的最广泛使用的探针。然而使用
IAA
进行半胱氨酸分析时存在一些问题，包括（
1
）与其他亲核氨基酸（如赖氨酸和丝氨酸）以及氧化硫醇的副反应；（
2
）由于功能性半胱氨酸的反应性相对较低，因此需要大量过量的
IAA
来良好地标记功能性半胱氨酸。这限制了其仅标记细胞裂解物而不标记活细胞的应用；（
3
）
IAA
的高工作浓度具有高毒性；（
4
）其生物稳定性较低。因此，开发新的半胱氨酸反应性化合物作为更好的半胱氨酸探针是推进
ABPP
和其他研究半胱氨酸生物学实验的活跃研究领域之一。
作者对使用丙烯酰胺化合物作为半胱氨酸反应性探针，其比碘乙酰胺具有更高的生物稳定性，并且通过巯基
-
迈克尔加成反应对半胱氨酸上的巯基具有优异的选择性。为了将丙烯酰胺化合物开发成潜在的半胱氨酸反应探针，作者考虑到吲哚氮由于其芳香性，其孤对π电子在整个吲哚环上离域，是丙烯酰胺掺入和活化的合适支架。
图
1. NAIs
和
NAIAs
的结构
本文中，作者报道了一类半胱氨酸反应性化合物，
N-
丙烯酰基吲哚（
NAIs
）和
N-
丙烯酰基吲哚啉
-alkynes
（
NAIAs
），它们在吲哚氮上含有丙烯酰胺弹头。
通过体外
LC-MS
的验证，作者发现
NAIAs
具有比
IAA
更好的半胱氨酸反应性及选择性，同时其在缓冲水溶液的稳定性更高，同时相较于马来酰亚胺炔烃（
MIA
）这种同样良好的半胱氨酸反应性探针，
NAIAs
对
GSH
的反应较慢。相较于
NAIAs
，
NAines
则缺乏π电子的离域，反应性较上述探针都差。
图
2.
缓冲水溶液中
Cys
反应性化合物与氨基酸反应的
LC
–
MS
分析。（
a
）显示
NAIA-5
与
N-
乙酰半胱氨酸甲酯（
N-Ac-Cys
OMe
）（一种
N-
和
C-
末端保护的半胱氨酸）的硫醇
-Michel
加成形成加合物产物的化学方程式。（
b
）
NAIA-5
与
N-
乙酰半胱氨酸甲酯孵育
MS
图。
m/z=325
和
502
时的选定离子色谱图（
SIC
），分别对应于
[NIA-5+H]+
和
[Adduct+H]]+
的分子离子。（
c
）与
N-Ac-Cys-OMe
孵育后
Cys
反应性化合物浓度随时间的变化。（
d
）半胱氨酸反应性化合物与
N-Ac-Cys-OMe
之间反应的生物分子速率常数。（
e
）与氨基酸孵育
30
分钟后
NAIA-5
水平的变化（
n=3
）。（
f
）在不存在
Cys
的情况下
NAIA-5
在缓冲水溶液中的稳定性（
n
＝
3
）。
接下来作者研究了
NAIA
在细胞裂解物和活细胞中标记功能性半胱氨酸的能力，同样的发现较之于
IAA
和
MIA
，
NAIA-4
和
NAIA-5
可以更多、更快速的标记半胱氨酸。同时作者发现
NAIAs
的半胱氨酸标记的优异性能不限定于特定的细胞系。
图
3.
基于凝胶的
ABPP
实验证明了
NAIA-5
对细胞裂解液和活细胞水平的优异
Cys
标记。
而后作者为了更好的验证
NAIA
在活细胞中更好的标记半胱氨酸的潜在机制，通过共聚焦荧光成像实验显示在用
NAIA-5
处理的细胞中发现明显高于
IAA
的荧光强度，表明
NAIA-5
对反应性半胱氨酸的标记更多。值得注意的是，用
NAIA-5
处理
15
分钟的细胞已经显示出非常强的荧光强度，而
IAA
处理的细胞在
15
分钟时显示出弱得多的荧光。这表明
NAIA-5
在活细胞中表现出良好的细胞通透性和与半胱氨酸的快速反应动力学，其中后者与我们从
LC
–
MS
实验中获得的体外结果一致，从而使
NAIA-5
能够快速捕获和标记细胞中的反应性半胱氨酸。
NAIA-5
在胞质溶胶和细胞核中都显示出良好的蛋白质标记，而
IAA
对细胞核蛋白质的标记相对较低。而且
WST-8
和
MTT
分析所示
NAIA-4
和
NAIA-5
分别表现出比
IAA
低得多的细胞毒性。
图
4.
共聚焦荧光成像和细胞活力测定揭示了
NAIA
在活细胞中硫醇标记方面的优越性能。
广泛硫醇捕获技术，如
OxICAT
（
ICAT=
同位素编码的亲和标签），在研究硫醇氧化方面取得了成功，但由于硫醇氧化的高度动态性修饰其可能在整个细胞裂解过程中导致这些修饰的损失。在活细胞中捕获游离硫醇可能是防止氧化修饰损失的好策略，但这一点尚未实现。鉴于活性半胱氨酸在活细胞中的快速和更好的标记，以及
NAIAs
与共聚焦荧光成像的兼容性，作者将
NAIAs
用作成像探针，用于研究面临氧化应激的细胞中硫醇反应性
/
修饰的动态变化。
作者通过
NAIA-5
捕获游离硫醇并通过共聚焦荧光显微镜成像，发现
NAIA-5
标记的强荧光，而使用相同的成像参数在
IAA
标记的细胞中几乎没有检测到荧光，表明
NAIA-5
对游离硫醇的标记和捕获比
IAA
快得多。在
NAIA-5
标记的细胞中发现
H2O2
剂量依赖性的细胞荧光强度降低，并且当与抗氧化剂
N-
乙酰半胱氨酸（
NAC
）共同孵育时恢复。说明
NAIA-5
能够探测细胞巯基氧化的变化。有趣的是，在
H2O2
刺激下，却无法观察到
IAA
标记的细胞的荧光强度发生统计学上的显著变化。
而后作者利用
NAI/NAIA
对捕获氧化硫醇，并通过共聚焦荧光显微镜对其进行成像，发现
H2O2
剂量依赖性的荧光强度增加，表明
NAI/NAIA
偶联成功捕获和成像氧化硫醇，并监测其在面临氧化应激的细胞中的升高水平。而且
NAC
与
H2O2
共孵育会减弱增强的荧光强度。即
NAI/NAIA
对在活细胞中捕获
/
标记细胞硫醇的准备状态使其能够作为成像探针，以高空间分辨率研究细胞硫醇活性的氧化修饰和其他动态变化。
图
5. NAIA-5
允许通过共聚焦荧光显微镜成功成像氧化应激下细胞中硫醇反应性的变化
通过点击化学安装去硫生物素代替成像实验中使用的罗丹明，作者对探针标记氧化半胱氨酸进行了
MS
分析，在用溶剂载体、
H
2
O
2
和
H
2
O
2
+NAC
处理的
HepG2
细胞中平均检测到约
30000
个
NAIA-5
标记的肽，共鉴定出
12584
个半胱氨酸。在这些半胱氨酸中，用于氧化还原蛋白质组学的强大半胱氨酸反应性磷酸标记（
CPT
）平台尚未报告
5625
个半胱氨酸。突出了
NAIA-5
作为
MS
实验的半胱氨酸探针的强大应用。通过比较来自对照样品的半胱氨酸和来自用
H2O2
处理的细胞的半胱氨酸的
LFQ
强度，使得能够检查鉴定的半胱氨酸上的任何氧化修饰。发现在
H2O2
刺激的细胞中，
583
个半胱氨酸显示出更高的
LFQ
强度，表明它们被
H2O2
高度氧化。而在
H2O2
刺激的细胞中有
112
个半胱氨酸具有较低的
LFQ
强度（＜
0.25
倍）。
GO
显示，与其他已鉴定的半胱氨酸相比，这些半胱氨酸与对过氧化氢和氧化应激的反应更密切相关这表明在
H
2
O
2
刺激后，这些半胱氨酸的反应性可能通过还原或不可逆氧化而发生变化。
通过
LFQ
强度对比，发现
PRDX
蛋白家族、
TXNRD2
、
GPX4
以及
GADPH
等等半胱氨酸的氧化修饰位点以及可能的功能性。
作者将在
H2O2
处理下具有活性变化的
696
个半胱氨酸与来自
CPT
的已报道的氧化还原蛋白质组学结果进行了比较。
NAI/NAIA-5
偶联能够分析
CPT
未报道的
338
种独特的氧化还原敏感半胱氨酸。重要的是，这些半胱氨酸与细胞对氧化应激的反应密切相关，并且能够介导氧化修饰。这展示了使用
NAI/NAIA
偶联来分析这些新半胱氨酸在研究硫醇氧化和半胱氨酸氧化还原生物学方面的价值。
图
6. NAI/NAIA-5
对探针标记通过
MS
实验鉴定氧化应激下细胞中的氧化半胱氨酸以及
GO
分析结果。
其后作者将
NAIAs
应用于基于质谱的
ABPP
实验中与
IAA
进行对比，在所有处理的样品中，发现
NAIA-5
修饰的肽数量明显多于
IAA
（
NAIA-5
和
IAA
修饰的平均数量分别为
5269
和
957
）。且信号强度高得多，表明
NAIA-5
在总体上比
IAA
描述了更多的半胱氨酸群体（
6387
对
1257
），通过
MSFragger
的开放搜索确定，在其他氨基酸上的非期望的脱靶标记比
IAA
少。
NAIA-5
鉴定的这些半胱氨酸位于
3394
种不同的蛋白质上，仅与
905
种同样被
IAA
标记的蛋白质重叠，而其余
2489
种蛋白质代表了本实验中
NAIA-5
所鉴定的具有功能性半胱氨酸的独特蛋白质库。与
IAA
衍生物
DBIA
鉴定的功能性半胱氨酸库相比，
NAIA-5
仍然能够通过独特地分析
530
种蛋白质，更重要的是
2990
种功能性半胱氨酸（
>NAIA-5
在实验中探测的
Cys
总数的
46%
）来显著扩大库。与其他报道的在最佳条件下使用
IAA
或使用高级化学可裂解连接体的半胱氨酸预填充实验相比，
NAIA-5
还鉴定了大量独特功能的半胱氨酸（
>2700
）值得注意的是，实验中
NAIA-5
的工作浓度（
10µM
）远低于报告研究中的
DBIA
（
500µM
），预计在更高的工作浓度下，
NAIA-5
会进一步增加一些半胱氨酸和蛋白质。所有这些结果都强调，
NAIA-5
即使不比优化的和当前最先进的半胱氨酸反应性探针更好，也与之相当
为了研究
NAIA-5
和
IAA
标记蛋白的性质，作者利用
DrugBank
数据库和
GO
分析分别检查药效团对这些标记蛋白的药物可用性及其生物功能。发现
84%
的
NAIA-5
标记的蛋白质不在
DrugBank
（非
DrugBank
蛋白质）的列表中，根据
GO
分析，对于带有
NAIA-5
标记的
DrugBank
（
DrugBank
蛋白质）列表中的蛋白质，它们大多是酶。非
DrugBank
蛋白质在其生物学功能方面表现出非常不同的特征，参与基因表达和调节的蛋白质是最大的类别。对来自
NAIA-5
的分析蛋白调控的生物过程的进一步
GO
分析显示，
650
个过程是
NAIA-5
特有的，在
IAA
分析中没有发现，与基因表达和调控相关的过程对前
20
个独特过程有显著贡献。
后续的相关
MS
结果分析
NAIA
相较于
IAA
和
DBIA
，都具有更多的修饰肽以及独特的半胱氨酸蛋白质群体。因此，
NAIA
在活细胞实验中的优异性能应有助于发现一个独特的功能性半胱氨酸库。同时支持
NAIAs
在不同生物样品和不同实验装置中用于蛋白质组全半胱氨酸图谱的稳健应用。
图
7.
基于
LC
–
MS/MS
的化学蛋白质组学实验，通过
NAIA-5
和
IAA
研究
HepG2
细胞裂解物和
HepG2
活细胞中的
Cys
图谱。
最后，作者在竞争性的基于
MS
的
ABPP
实验中，发现这些半胱氨酸中的许多可通过定位配体
CL-Sc
连接，并且是调节已知癌症驱动因子活性的潜在热点。
图
8.
使用检测配体用基于
MS
的
ABPP
实验揭示
NAIA-5
探针修饰的半胱氨酸是可连接的
NAIA
在共价配体筛选中的进一步应用允许发现靶向新的可配体半胱氨酸和蛋白质的苗头化合物。已发现苗头化合物之一
CL1
主要通过与
Rac1
的
Cys178
结合从而抑制
Rac1
信号传导，将
HepG2
细胞的细胞周期阻滞在
G1
期。
图
9. NAIA-5
能够鉴定新的共价配体
CL1
介导
HepG2
细胞
G1
期细胞周期阻滞
总的来说，作者开发了新的半胱氨酸反应性探针
NAIAs
来更有效地探测功能性半胱氨酸，分析氧化半胱氨酸以及一个新的可连接半胱氨酸和蛋白质库。同时证明了
NAIA
发现靶向这些半胱氨酸和蛋白质的先导化合物的能力。其可用于推进全蛋白质组分析和可连接半胱氨酸和氧化硫醇的成像。
