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科研 | Sci. Total Environ.（IF：7.963）：南瓜属植物根微生物组移植和原位干旱适应的宏基因组检查

时间：2022-06-24 来源： 浏览：

科研 | Sci. Total Environ.（IF：7.963）：南瓜属植物根微生物组移植和原位干旱适应的宏基因组检查

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编译：微科盟 鼻涕 ，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

干旱地区含有多种能够在干旱条件下生存的微生物，其中部分微生物可以通过与干旱胁迫条件下的植物互作来改善植物健康。研究人员采用 原位试验和同质园试验 的方法，利用 原位采集的土壤作为微生物源 ，在不同干旱程度的土壤中种植植物，研究了 干旱和潮湿条件下美国南瓜（ Cucurbita pepo   L.）根系微生物群落 。通过 16S rRNA基因测序 （N = 48）描述和分析了来自 土壤、根际和根内 的细菌多样性。变形菌门（Proteobacteria）的丰度在湿润和干旱地区最高，而放线菌门（Actinobacteriota）的丰度在干旱地区最高。β多样性分析表明， 干旱和潮湿微生物群落之间存在分离，且干旱程度和土壤pH可以解释这一现象。 在同质园试验中，这些微生物群落之间的差异得到了保持，这表明在温室中移植多样性是可能的。共检测到细菌属1009种，其中199种与干旱条件下的根有关。我们通过16S和宏基因组学测序，鉴定了干旱相关类群，如 Celloibrio 、 Ensifer adhaerens 和 Streptomyces flavovariabilis 。我们还通过 根际的宏基因组测序 （N = 6），在南瓜核心宏基因组中鉴定了2969个蛋白家族，发现干旱地区（924个）的纯蛋白家族数量高于潮湿地区（158个）的数量。此外，还发现干旱条件富集了蛋白质降解和折叠、氧化应激、相容溶质合成以及与渗透调节相关的离子泵的基因，植物表型能够将细菌群落与植物生长联系起来。该研究结果表明了 在干旱地区评估微生物群落多样性和识别参与植物微生物相互作用的关键物种和基因是可能的。

图文摘要

论文ID

原 名： Squash root microbiome transplants and metagenomic inspection for in situ arid adaptations

译 名 ： 南瓜属植物根微生物组移植和原位干旱适应的宏基因组检查

期刊 ： Science of the Total Environment

IF： 7.963

发表时间： 2021.9

通讯作 者： Luis D. Alcaraz

通讯作者单位： 墨西哥国立自治大学

DOI号： 10.1016/j.scitotenv.2021.150136

实验设计

结果和讨论

1. 南瓜根微生物组与植物根微生物组获取的两步模型一致
16S rRNA基因测序得到7,476,012对序列，长度为2.75 × 10 9  bp，合并序列共73,277个OTUs（表S2）。宏基因组测序得到247 × 10 6 条序列，组装成20 × 10 6 个contigs，代表5.19 × 10 9  bp，平均GC%为62.7，N50为894 bp（表S3）。
我们计算了平均16S rRNA基因多样性指数。在大多数情况下，土壤多样性值最大（Shannon = 7.31-7.99，Simpson = 0.996-0.999），接下来是根际（Shannon = 3.9-7.31, Simpson = 0.948-0.996），其次为根内（Shannon = 3.9-7.2，Simpson = 0.88-995）（图1A，表S2）。 Shannon和Simpson多样性指数在土壤与根际间（p < 1e-3）和土壤与根内（p < 1e-4）差异显著，但是在根际与根内间差异不显著。 因此，在南瓜微生物组中观察到的从土壤到根的多样性减少与两步模型一致。
除不同的多样性水平外，我们发现74个属只存在于根际，70个属只存在于根内（表S4），根内专属属包括植物胞间病原菌果胶杆菌（ Pectobacterium ）和根部分离的内生菌罗氏菌（ Rothia ）。在所有样品中，变形菌门（Proteobacteria）是最丰富的门（图1B），特别是在根内（平均= 76%）和根际（69%）中较丰富，而在土壤中相对丰富度较低（32%）。 除了美国南瓜（ Cucurbita pepo ）外，苜蓿（ Medicago sativa ）、番茄（ Solanum lycopersicum ）、百脉根（ Lotus corniculatus ）、非洲栽培稻（ Oryza glaberrima ）和水稻（ Oryza sativa ）等植物的根际和根内层的变形菌门相对丰度增加，这与多样性水平降低有关 。
 
图1. 湿润和干旱条件下南瓜根微生物群落多样性的门水平丰度。A）土壤、根际（rhizo）和根内（endo）的Shannon多样性指数。B）大多数丰富的门是根据土壤、根际和根内层的气候条件（潮湿或干燥）从原位收集的植物和普通的花园实验（土壤接种剂）进行分类的。
 
2. 干旱和潮湿的土壤含有不同的细菌群落
在原位实验和同质园实验中，变形菌门在潮湿的土壤样品中有所增加，而革兰氏阳性放线菌门和厚壁菌门在干旱条件下有所增加（图1B）。研究发现根内样品中放线菌门（干旱样品中平均9%，潮湿样品中平均5%）和厚壁菌门（干旱样品中1.3%，潮湿样品中0.7%）的比例存在显著差异（t-test，p ≤ 0.05）。 干旱地区和根部革兰氏阳性细菌（放线菌门和厚壁菌门）的增加与以前报道的群落组成相似。 革兰氏阳性细菌在干旱地区的数量更多，可能是因为它们有更厚的细胞壁，而且一些类群是孢子形成的微生物，因此它们能够抵抗干旱。
研究共有1,009个细菌属被分类，其中199个属属于干旱气候，77个属属于湿润气候，733个属属于两种气候（图S2）。一些来自干旱地区丰富的属，如 Yaniella 、 Woeseia 、 Salinimicrobium 具有耐盐的特性，表明了这些群落的特定作用。通过DESeq2分析计算了湿润和干旱条件下的差异显著的OTUs（p ≤ 0.05, Benjamini-Hochberg），发现了不同的属，如 Arenimonas 、 Azoarcus 、 Algoriphagus 和 Thauera （图S5和S6）。在干旱气候条件下，从根内样品中鉴定出 Arenimonas 和 Azoarcus （表S5）。 已有报道表明， Azoarcus 可以在根上定殖，部分物种具有固氮能力。 由于 Arenimonas 分离自土壤和根际，因此我们预测到了它的存在。 Algoriphagus 和 Thauera 在根际中富集（表S6），虽然目前还没有报道过在根际种分离到该菌株，但有研究从污染土壤中分离出了可分解芳香族化合物的 Algoriphagus 和 Thauera 。因此，这两个属可能在促进南瓜属植物在污染土壤中的生长或分解芳香根系分泌物中发挥重要作用。
 
3. 同质园实验恢复原位细菌多样性
在原位和同质园实验样品中发现了干旱地区放线菌的增加（图1B）。使用Unweighted Unifrac距离进行多维尺度分析（MDS）揭示了干旱和潮湿微生物群落之间的离散分组。根据PERMANOVA分析（999个排列，p< 0.001），原位和同质园实验在排序中观察到干旱和潮湿样品的分化，两组之间没有差异（图2）。尽管根据先前报道施肥处理降低了微生物多样性（表S2），但由于干旱和潮湿来源的施肥群落的差异，因此肥料处理促进的群落结构变化并不意外（图2）。最后，灭菌对照与其他样品分离，强化了细菌群落差异来源于源土壤的观点，灭菌对照的细菌多样性主要是温室管理的结果（图2）。这些结果表明， 干旱地区土壤微生物群落的小剂量接种可以输出到其他系统，以恢复适应干旱的关键类群，群落在一定程度上保留其特征，以响应迁地特征作为养分供应。
基于土壤物理化学特征，建立了原位采集样品的主坐标约束分析（CAP）（表1）。该分析表明，湿润和干旱地区群落之间的差异与Al和pH有关（图S3）。由于生活在极端pH环境中限制了生存， pH值是细菌群落类型的一个重要预测指标 。生活在pH胁迫下的群落往往有系统相似的生物，如酸杆菌（Acidobacteriota），其相对丰度随着土壤酸度的增加而增加。最近的一项研究评估了全球细菌分布模式，确定pH值、干旱和生态系统生产力是多样性的最佳预测因子。
同质园试验的主坐标（CAP）排序受植物表型性状控制（表S1），支持MDS中观察到的相同模式（图S3）。然而，CAP排序允许我们将微生物组的差异与植物表型联系起来，表明来自干旱环境的微生物组样本分成一个单独的组，高干旱水平与植物叶绿素和类胡萝卜素浓度相关（图S3）。
 
图2. 南瓜微生物群落根据它们的来源环境分开，但同质园实验和原位样品是混合的。使用16S rRNA基因扩增数据，β-多样性显示为unweighted Unifrac距离，并绘制为多维尺度（MDS）排序。灭菌对照集中在左侧，与土壤接种剂及其土壤和根际分开（21.9% variance, Axis1）MDS轴2将干旱和潮湿的微生物群落分开（7.0%）。无论是原位还是同质园实验样品，土壤、根际和内层群落样品之间的距离较近。
 
表1. 土壤的取样位置和物理化学特征。
根据干旱指数对采样点进行排序（AI）。 总有机碳，TOC；总氮，TN；总磷，TP。
 
4. 将根部16S rRNA基因微生物组多样性、宏基因组学测序和美国南瓜（ C. pepo ）表型联系起来
有趣的是，一些差异（DESeq2）丰富的属在不同气候条件下比较（表S5和S6）与植物表型特征相关（表S1，图3）。Spearman相关性系数差异具有统计学意义（p ≤ 0.05），表明 根际和根内有25个属与植物表型相关 （图3；图S4）。纤维弧菌属（ Cellvibrio ）植物的丰度与叶表面（r = 0.7）、株高（r= 0.7）、茎粗（r = 0.7）、总叶绿素含量（r = 0.8）、类胡萝卜素水平（r = 0.7）和地上部生物量（r = 0.7）呈正相关（图3；图S4）。纤维弧菌属（ Cellvibrio ）在植物中很常见，具有固氮活性，可以促进地上部生物量的增加。同样，剑菌属（ Ensifer ）的相对丰度与地上部生物量（r = 0.7）、茎（r = 0.8）和株高（r =0.7）呈正相关（图S4）。粘着剑菌（ Ensifer adhaerens ）通过分泌植物激素和铁载体及溶解磷酸盐促进植物生长。所有根样（根际和根内）均发现剑菌属（ Ensifer ），表明该属与南瓜（ C. pepo ）的相关性。食酸菌属（ Acidovorax ）也普遍存在，并与植物表型呈正相关（类胡萝卜素浓度r = 0.7），但在潮湿的样品中富集（图S4）。实验结果表明， Acidovorax radicis 对大麦根、茎质量有一定影响。因此，来自干旱地区的群落成员可能具有促进植物生长的潜力，并可能与保护作物免受气候变化引起的干旱有关。
令人惊讶的是， 甲基杆菌属（ Methylobacterium ）和新鞘脂菌属（ Novosphingobium ）传统上被描述为植物共生体，它们与一些植物表型性状呈负相关 （甲基杆菌属叶绿素浓度和类胡萝卜水平分别为r = -0.7和r = -0.6；新鞘脂菌属叶表面、总叶绿素含量、类胡萝卜素含量和地上部生物量分别为r = -0.8，-0.7，-0.7和-0.7）（图S4）。
此外，我们在宏基因组测序中寻找进一步的证据和验证细菌与植物表型特征相关的序列。参考基因组的宏基因组招募提供了支持16S rRNA基因发现的证据，并允许对物种进行鉴定（图3）。 在宏基因组测序中也发现了在所有植物根取样微生物群中检测到的属的一些物种 ，如贪噬菌属（ Variovorax ）和食酸菌属（ Acidovorax ），被鉴定为 V. paradoxus 和 A. radicis 。在干旱环境下，通过对 Cellvibrio  sp. PSBB006 、 Stenotrophomonas rhizophila 、 Streptomyces flavovariabilis 、 Arenimonas metalli 和 Glycomyces sambucus 等细菌的宏基因组序列分析，证实了微生物组显著富集OTUs（p ≤ 0.05，Benjamini-Hochberg）（图3）。在湿润环境下，通过宏基因组筛选， Delftia acidovorans 和 Bradyrhizobium lablabi 与DESeq2富集的OTUs相一致（图3）。招募基因组的完整列表见表S8。
利用高粱植物进行的实验分析了根相关细菌的微生物组和转录组，发现在干旱条件下，植物分泌甘油醛-3-磷酸来吸引放线菌。因此，与植物性状呈正相关的放线菌群可能有助于植物在干旱条件下生存。 Streptomyces 、 Glymocyces 、   Geodermatophilus 和   Pseudonocardia 的丰度与叶绿素产量呈正相关。此外，大量宏基因组序列被归为放线菌属（Actinobacteriota），尤其是链霉菌（ Streptomyces ）。在我们的宏基因组测序数据中，链霉菌（ Streptomyces ）的高丰度是突出的。之前的报道已经将链霉菌菌株描述为植物生长促进细菌，可以合成生长素、抗生素和铁载体，它们的存在与抗旱能力有关。
 
图3. 植物表型、微生物组和宏基因组招募之间的联系。A）通过对比两种土壤的对数倍变化（LFC）比值，比较和鉴定干旱和湿润土壤间显著差异OTUs（P ≤ 0.05，FDR）。表S5和表S6中列出了差异分类群。B）南瓜核心微生物组定义为同质园实验或原位根相关微生物交集的集合。C）植物表型与干旱或湿润土壤富集的属的相对丰度（表S5和S6）及植物表型（表S1）相关。D）宏基因组测序分箱序列与细菌基因组相反，在热图中，通过16S rRNA基因扩增子鉴定的相同属的选定物种，鉴定到了物种水平，验证了16S数据。宏基因组覆盖率是参照基因组相对于每个宏基因组排列的百分比。在左侧热图面板中，颜色键表示南瓜核心微生物的归属、湿润或干旱的16S富集以及表型相关性。
 
5. 宏基因组学测序揭示了潮湿和干旱土壤条件下南瓜微生物组的差异
从宏基因组中发现了用于注释和进一步比较分析的编码基因及其预测蛋白。利用Refseq衍生的注释，从南瓜宏基因组中发现了1,192,784个预测蛋白，其中27,767个在所有样本之间共享（图S5）。然后，使用SEED分类（见方法），鉴定了2.969个在两种气候条件下检测到的预测蛋白家族。其中，158个蛋白家族仅来自湿润地区，924个蛋白家族仅来自干旱地区（表S9）。
使用DESeq2分析比较了干旱和潮湿条件下宏基因组之间基因丰度的显著差异（p ≤ 0.05，Benjamini-Hochberg）（图S5；表S10和S11）。本文发现了组氨酸激酶（BaeS）、外膜蛋白酶（DegS）、铜敏感调节剂（CpxR）和在干旱位点富集的感觉组氨酸激酶（QseC）（表S10）。 这些蛋白参与感知和响应胞外质应激。激活对细胞包膜损伤的反应对于在干燥引起的膜完整性丧失中存活至关重要。 来自干旱地区的高丰度杂类包括香叶基香叶基/异戊二烯基还原酶、磷脂酰甘油磷酸酶、类浮游物 YqiK Lipid A 输出蛋白（表S9和S10）。如前所述，这些蛋白质可能与细胞质外应激中的膜功能有关。关于渗透压的平衡，我们确定来自干旱样品的蛋白质与相容溶质四氢嘧啶（EctA）、羟基四氢嘧啶（EctD）、渗透质胆碱（OpuBB）、甘氨酸甜菜碱（OpuAC）和海藻糖的 ABC 转运蛋白的合成有关，并且 N(+)/H(+) 反向转运蛋白显着富集或排除（图S6；表S10、S11和S12）。霉菌硫醇合酶（MshD）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶（参与谷胱甘肽合成）分别在干旱条件下被排除和富集（表S9和S10）。霉硫醇和谷胱甘肽可能参与抵抗干旱引起的氧化应激。干旱条件下富集的营养同化相关蛋白包括木聚糖酶和D-3羟基丁酸低聚物水解酶（表S9和S10）。这两种酶负责生物聚合物的断裂，并可能降解干燥贫营养土壤中丰富的顽固碳源。 预测的蛋白质是与干旱环境相关的分子机制的一部分，概括为七个基因适应: 应激感知和反应、蛋白质降解、渗透调节、氧化应激应对、细胞壁和分解代谢 （图4）。除了前面描述的类别外，我们预测了与趋化性、鞭毛组装、运动性和分泌系统III、IV和VI相关的蛋白质，这些都是独立于气候条件确定的（图S6）。趋化和鞭毛蛋白感知和向植物信号移动，III型和IV型分泌系统介导与宿主物种的相互作用。无论样品的气候来源如何，几乎所有参与氮循环的酶都能被识别出来（图S6）。在干旱来源的样品中，观察到的基因的丰度表明，羟胺水平可以通过羟胺还原酶（Hpc）产生氨。在湿润地区，羟胺脱氢酶（Hao）能将羟胺脱氢为亚硝酸盐（图S6）。
在干旱环境中富集的其他蛋白质包括外排转运蛋白RND、倍他酰胺酶、膜蛋白插入酶（YidC）、RHS家族、类蛋白、α-2-巨球蛋白家族和TonB受体（图4，图S5）。α-2-巨球蛋白已在真核相互作用的细菌中发现，可能抑制宿主蛋白酶。相反，在一些病原体中，类德克萨斯蛋白参与毒素表达。除了宿主相互作用外，RHS 蛋白介导细胞内竞争，而 β-内酰胺酶和 RND 外排转运蛋白促进抗生素耐药性。在南瓜根宏基因组中发现的其他与植物-细菌相互作用相关的基因是TonB受体，铁载体和铁螯合分子可能驱动细菌-细菌相互作用。此外，TonB依赖的受体可能参与植物碳水化合物同化。
接下来的工作将测试提到的一些基因的表达谱。我们对宏转录组学方法持谨慎态度，因为在受控条件和单物种实验下，mRNAs操纵子的平均半衰期小于6.8分钟，要想获得具有生物学意义的完整剖面，测序深度将会超出本工作的范围。由于细菌基因组中减少尺寸的选择压力，干旱和潮湿宏基因组之间的显着差异令人受到启发。 细菌基因组减少与加速进化、生长有关，并且一些丢失的基因在选定条件下有益但在替代环境中有害，这表明基因含量的差异可能适用于实验条件 。虽然我们没有检测到基因组的减少，但在对比条件下相同的植物拥有不同的分类群和基因，因此鼓励微生物组作为多样性和本地适应的基因库。
 
图4. 南瓜对干旱环境的微生物群落适应性总结。从主要宏基因组预测蛋白质特征构建的代谢建议。宏基因组适应的主要识别功能是根据其分子或细胞功能的颜色编码和分类。

结论

本研究的实验设计能够收集原位土壤多样性，将其用作同质园实验的小型接种剂，同时保留其源性状。 本研究在来自干旱和潮湿环境的样本中鉴定了共享和差异的根相关细菌分类群和基因，并保存环境样本和同质园实验中来自潮湿和干旱地点的具有显著性差异的土壤微生物群。 由于涉及土壤接种物的处理由一小部分底物组成，这种异地微生物群保护尤其值得注意。结合分类分化，发现了与干旱环境适应相关的编码基因，描述了与植物相互作用和促进植物生长相关的细菌和基因，同时提供了应对氢化物胁迫的代谢能力库。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0048969721052116
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