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CCB | 富电子核糖核苷代谢结合增强APEX-seq分析空间受限的新生转录组

时间：2023-08-01 来源： 浏览：

CCB | 富电子核糖核苷代谢结合增强APEX-seq分析空间受限的新生转录组

Chenguang Liu 靶标发现与药物研发
靶标发现与药物研发

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大家好，今天和大家分享一篇 2022 年发表于 Cell Chemical Biology 的研究论文， Metabolic incorporation of electron-rich ribonucleosides enhances APEX-seq for profiling spatially restricted nascent transcriptome ，通讯作者是来自北京大学的 邹鹏特聘研究员 。

研究背景： 新转录 RNA 的亚细胞器定位在多种细胞类型中被观察到，其与基因表达调控、结构支持、局部蛋白翻译和发育密切相关。在后生动物中，核膜内层的致密结构称为核层（ NL ），与核层接触的基因区域称为核层相关结构域（ LADs ），这是一种抑制基因表达的压抑环境，这一微环境调控与多种疾病相关，因此解析 RNA 在 NL 的转录组全谱有利于我们理解亚细胞 RNA 定位的功能特点并启发我们找到解决疾病的方法。

研究结果：

富电子核糖核苷促进 APEX 介导的 RNA 标记：
经典 APEX2-seq 是通过将生物素苯酚（ BP ）催化为苯氧基自由基后继续与鸟苷酸结合，通过生物素标签完成分选与鉴定，但鸟苷酸本身并不是富电核糖核苷酸，标记效果一般且选择性差， 因此，本研究中作者选用氧化还原电位更低的 s6G 和 s4U 两种改造核糖核苷辅助标记 。
研究中发现，掺入 s6G/s4U 非天然核糖核苷后，相较于天然标记状态分别提高了 9 倍和 3 倍，后续结果也证明 掺入富电子非天然核糖核苷代谢能够增强体外 APEX-seq （ MERR APEX-seq ）的标记效率 ，见图 1A-B 。作者以研究全面的线粒体基质为模型，评价 MERR APEX-seq 在细胞模型中的标记效率，在免疫成像中观察到 APEX2 与 Biotin 共定位的实验现象证明标记成功，见图 2A-B 。在 RNA 提取实验中，使用 DNase Ⅰ 酶去除残留的 DNA 污染，并质控 RNA 质量数（ RQN ）＞ 8.0 的样本进行后续分析。相较于普通富集样品， s6G/s4U 代谢掺入 RNA 后富集样品分别高出 39 倍和 25 倍，并表现出高度空间特异性，见图 2C 。同时，细胞内试验结果表明，生物素苯酚（ BP ）有着比生物素苯胺（ BA ）更好的 RNA 回收效率，这可能是因为细胞内存在一些天然的自由基猝灭剂干扰所导致。
Figure 1. Development of APEX-mediated electron-rich ribonucleoside labeling strategy in vitro    
Figure 2. Characterization of MERR APEX-seq in mitochondrial matrix
ER 膜转录组富集验证 MERR APEX-seq 具有较高的空间特异性：
在完成上述 MERR APEX-seq 的基本评估后，作者将其应用到内质网的 RNA 分析中，这是因为多数分泌蛋白以内质网为起点开始翻译 - 加工 - 迁移 - 分泌的过程，理论上能够捕捉到更多 rRNA 信息。作者将 APEX 定位于 ERM （ APEX2-ERM ），对照组则是将 APEX2 定位于细胞质中（ APEX2-NES ），见图 3A-C 。 MERR APEX-seq 表现出高度空间特异性，发现 943/1035 （ 91% ）的分泌注释 RNA ，见图 3E-F 。
Figure 3. MERR APEX-seq reveals subcellular transcriptome at the ER membrane
分析核层新生转录组揭示染色质相关的功能特征：
作者构建 APEX2-LMNB1 稳转 293T 细胞，这一模型相较于线粒体基质 MERR APEX-seq 不同， NL 是细胞核中的无界区域， BP 自由基更容易扩散更具挑战性。实验中也观察到， Biotin 的信号在细胞核中弥散可能在短时间内难以被 H2O2 完成催化标记。两种阳性标记物 HOXD10 和 KIAA0907 的回收率比阴性标记物 mt-mRNA MTCO2 高出 16 倍，见图 4A-C 。
实验中发现，不同于 MITO APEX-seq 与 MITO MERR APEX-seq 的结果相似性， LMNB1 APEX-seq 与 LMNB1 MERR APEX-seq 捕捉到的 RNA 有所不同，且后者的表现更好且特异性高，见图 4D 。许多基因本身在核纤层是被转录抑制的，因此作者所标记到的 RNA 绝大多数是转录后修饰的 RNA 。分析中作者发现， XIST 被显著富集，这有利于 X 染色体被招募进细胞核中，与其生物学调控密切相关，在荧光分析也观察到这些被富集的 XIST 是近核纤层的，见图 4E-F 。
基因本体生物学过程分析显示， NL 附近新转录的 mRNA 往往编码参与组蛋白修饰、染色体构象改变、 RNA 剪接等生物学过程，见图 5A-B 。在 LMNB1 MERR APEX-seq 数据中发现，该技术能够更好地保留内含子信息，这其中就包括 TONSL/CLK3 两个典例，见图 5C-E 。
Figure 4. MERR APEX-seq profiling of transcripts at the nuclear lamina
Figure 5. Analysis of nuclear lamina-associated transcriptome
MERR APEX-seq 倾向于鉴定新转录的 RNA ：
在 MITO MERR APEX-seq 实验中，通过比较不同的 s6G/s4U 的孵育时间比较 APEX 的标记效率，发现仅孵育 0.5h 后， APEX 标记显著增强，见图 6A-B 。而 ER MERR APEX-seq 则延后至 1h ，这可能是因为从核内运输至内质网也需要一定时间，见图 6C 。在随后的放线菌 D （ actD ）抑制 RNA 转录的实验中再次验证 MERR APEX-seq 主要标记新转录的 RNA ，见图 6D-F 。
Figure 6. Characterizing the sensitivity of MERR APEX labeling toward newly transcribed RNAs

总结：

本研究开创通过代谢方式掺入富电子的非天然核糖核苷（ s6G/s4U ）至新转录的 RNA 来提高 APEX-seq 的敏感性（ MERR APEX-seq ）。在 s6G/s4U 结合到转录物中后，过氧化氢催化 APEX 介导标记邻近依赖 RNA 生物素化。 MERR APEX-seq 可在多亚细胞器中完成 RNA 捕获与分析，并且具有高度空间特异性，这使得非天然核糖核苷的代谢结合在时间维度上研究亚细胞器反应前景广阔。

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