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大连化物所周雍进：在超级酵母底盘中过量生产3-羟基丙酸甲酯

时间：2023-07-26 来源： 浏览：

大连化物所周雍进：在超级酵母底盘中过量生产3-羟基丙酸甲酯

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3-羟基丙酸甲酯(3-HP) 是一种用于生产丙烯酸、丙烯酰胺和可生物降解聚合物的 平台化学品 。通过使用丙二酰辅酶A还原酶从丙二酰辅酶A生产3-HP已经建立了几个微生物细胞工厂，但都受限于前体和辅因子供应不足。
中国科学院大连化学物理研究所周雍进团队 近日在Bioresource Technology发表《在超级酵母底盘中过量生产3-羟基丙酸甲酯》一文，在前体丙二酰辅酶A和辅因子NADPH供应充足的超级酵母底盘中进行3-HP生物合成的优化，3-HP (1.4 g/L) 比野生型背景 高3倍 。

由于质粒丢失，在补料分批发酵中观察到工程菌株的不稳定性，这可能是由于有毒的中间体丙二酸半醛引起的。MCR-C的基因组整合编码MCR的C端能够实现稳定的基因表达和更高的3-HP产量，分批发酵时产量为4.4 g/L，补料分批发酵时为56.5 g/L，产量为0.31 g/g葡萄糖。

这是工程微生物中葡萄糖产生的最高3-HP产量。

01

优化MCR表达生产3-HP

据报道，将Mcr分割为2个酶可以改善3-HP的产生，Mcr-C（催化丙二酰辅酶A到丙二酸半醛）是一种限速酶，因此将MCR-C在高拷贝质粒中表达，MCR-N整合到基因组中（图1a），3-HP产量达到645 mg/L（图1b）。在质粒pESC中融合或单独表达MCR-C或MCR-N，利用亲和肽和柔性进行酶融合，避免了酶干扰（图1a）。

然而，所有构建体的的3-HP产量都没有单独表达MCR-C的产量高（图1b），表明单独表达MCR-C和MCR-N，且MCR-C表达水平更高有利于酿酒酵母中3-HP生产。此外，另一个质粒pYX212也用于表达Mcr-C，比pESC表达时3-HP产量提高2.2倍，达到1.3 g/L（图1c）。

含pESC质粒的菌株生长比低于含pYX212的菌株33%，这大概是含pYX212的质粒产量更低的原因，这两个质粒中的筛选标记也是不同的，pESC含HIS3，而pYX212含URA3，可能导致细胞生长和3-HP生产不同。
图1 优化Mcr表达促进3-HP合成。（a）不同酶表达模式；（b）不同菌株中3-HP生产；（c）不同质粒表达表达MCR-C的菌株3-HP生产和生长
02
改造中心代谢提高3-HP生产
3-HP生物合成要求等量的丙二酰辅酶A和双倍的NADPH，从而 丙二酰辅酶A和NADPH的供给可能是高水平生产3-HP的瓶颈 。改造中心碳代谢可能有助于增强丙二酰辅酶A和NADPH的供应。
因此，将之前构建的自由脂肪酸超级菌株代谢转化用于3-HP生产。恢复缺失的FAA1/4和POX1，并敲除FFA生物合成的过表达基因（RtFAS1/2和’TesA），创造了能有效供应丙二酰辅酶A和NADPH的底盘菌株SH03（图2和3a）。将MCR-C在质粒pYX212和MCR-N整合到基因组中导入这个超级底盘中， 3-HP产量达到1.3 g/L（图3b）。
葡萄糖浓度敏感型启动子PHXT1过表达脂肪酸合酶基因FAS1释放丙二酰COA和NADPH，允许FAS1在糖限制的情况下下调。尽管摇瓶中这个菌株产量仅轻微提高到1.4 g/L（图3b），这个策略可能对于长期的分批补料发酵时有利的，由于其能解耦细胞生长和产物合成。PTDH3启动子控制下基因组整合另一个MCR，(PTDH3-MCR-C和PTDH3-MCR-N)，3-HP产量进一步提高至2.4 g/L，提高了71%（图3b）。据推测，启动子PGAL和PTDH3使MCR在整个发酵过程中表达，以提高3-HP的产量。
图2. 从游离脂肪酸生产到3-HP生物合成的代谢转化
图3 改造中心代谢促进3-HP生产（a）过量生产FFA的酵母代谢转化为增强前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH供应的菌株，为3-HP生产的超级底盘。（b）背景菌株和超级底盘中3-HP的生产
03
分批补料发酵下质粒丢失
对恢复HIS的原生营养菌株SH14进行分批发酵培养评估其性能。菌株在24h达到最高3-HP生产，在24h后尽管持续的消耗葡萄糖和乙醇，3-HP仍然停止积累（图4a）。并观察到84.3% MCR-C表达质粒丢失（图4b），推测有毒中间体丙二酸酯会强制质粒损失（图4c）。因此，在大规模发酵中应特别注意保持酿酒酵母质粒的稳定性。
图4 生物反应器中SH14h补料分批发酵质粒损失。（a）指数补给策略下1L生物反应器中SH14分批补料发酵。（b）生物反应器中发酵液取样，稀释后涂布在YPD和SD板。质粒丢失的菌株无法在筛选SD培养基上生长，但是能再YPD平板上生长，因此质粒丢失速率为(140-22)/140 = 84.3%。（c）Mcr-C和Mcr-N催化丙二酰CoA到3-HP的反应。中间体丙二酸半醛对酵母有毒性，导致含有MCR-C的质粒丢失。
04
构建稳定菌株高水平生产3-HP
通过基因组整合MCR-C构建稳定菌株 。考虑搭配MCR-C需要高的表达水平，双向启动子PGAL1,10用于表达MCR-C，允许同时整合2个拷贝的MCR-C。生成的菌株SH17摇瓶水平生产3.5 g/L的3-HP，45%高于质粒表达的菌株（图5a）。补充UAR3筛选标记后生成菌株SH18，3-HP产量达到4.4 g/L（图5a）。SH18的分批补料发酵在整个发酵过程中连续积累3 HP，即使菌株在64h停止生长，这表明MCR在3-HP生物合成中稳定表达。最终3-HP产量达到 56.5 g/L （图5b），是目前的最高水平。
结果表明， 超级酵母底盘中通过代谢转化的稳定MCR表达释放了3-HP生产的巨大潜力 。
图5 基因组上稳定的MCR-C表达提高3-HP生产。（a）基因组整合MCR-C和恢复URA3促进3-HP生产。（b）稳定菌株SH18在1L生物反应器的分批补料发酵
05
总 结
在加强前体和辅因子的超级底盘中优化Mcr路径，实现了最高3-HP的生产（56.5 g/L）。以质粒为基础表达MCR-C导致质粒丢失，且3-HP生产水平比较低。基因组整合保证在长期补料分批发酵下稳定的基因表达。该研究表明，中心代谢和生物合成途径应进行优化，并适应稳定和高水平的生产化学品。

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