科研 | 南农（IF：5.640）：AT-5菌株对受阿特拉津污染的土壤生物增强效应及其对土壤微生物群落的影响（国人佳作）
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Microeco2016
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编译：微科盟 艾奥里亚 ，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。
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阿特拉津作为一种三嗪类除草剂，在世界范围内广泛应用。在我国境内，由于阿特拉津在前茬玉米作物中的应用，其残留对随后种植的甘薯作物产生了药害效应。用阿特拉津降解菌株对阿特拉津污染土壤进行生物强化被认为是去除土壤中阿特拉津最有潜力的方法。尽管如此，这种方法的可行性及其对土壤微生物群的影响仍需研究。本研究中，我们将一种阿特拉津降解菌株-- Paenarthrobacter sp. AT-5接种到受阿特拉津污染的农业土壤中，对生物强化过程以及随后引起的土壤微生物群重组变化进行研究。通过研究我们发现， AT-5菌株接种7 d后，有95.9%的阿特拉津在受5mg kg -1 阿特拉津污染的土壤中被去除 ，此外， 阿特拉津对甘薯的药害明显减轻。 qRT-PCR分析发现，接种的AT-5菌株在土壤中保持良好的活性及相对较高的丰度。 AT-5菌株的接种显著影响了土壤微生物群的群落结构 ，与此同时我们发现， 与阿特拉津降解相关的细菌丰度有所提高 。
论文ID
原 名： Bioaugmentation of Atrazine-Contaminated Soil With Paenarthrobacter sp. Strain AT-5 and Its Effect on the Soil Microbiome
译 名 ： Paenarthrobacter sp. AT-5菌株对受阿特拉津污染的土壤生物增强效应及其对土壤微生物群落的影响
期刊 ： Frontiers in Microbiology
IF： 5.64
发表时间： 2021.12.8
通讯作 者： 陈凯，徐希辉
通讯作者单位： 南京农业大学（Nanjing Agricultural University）
DOI号： 10.3389/fmicb.2021.771463
实验设计
研究结果
在为期14 d的培养周期中，有14.5%的阿特拉津在无菌土壤（经过灭菌的土壤）中被去除，这一结果表明 非生物因素对阿特拉津仅存在有限的去除效应 （图1）。与无菌土壤相比，生物强化处理（Atr-Bio）中阿特拉津的浓度显著降低。在培养结束时，阿特拉津在阿特拉津处理（Atr）和生物强化处理（Atr-Bio）的去除率分别为28.3%和97.9%。此外，Atr-Bio处理中阿特拉津的DT 50 和DT 90 值分别为1.2 d和3.9 d。这些结果表明， 土著微生物对阿特拉津的去除贡献不大，AT-5菌株主导了土壤中阿特拉津的去除 （ p < 0.01）。
图1 不同土壤样品中阿特拉津的随时间的去除及接种外源菌株后土壤微环境中trzN的qRT-PCR定量结果。 对照（Control）代表加标阿特拉津的原始土壤；灭菌土壤（Sterilized soil）代表加标阿特拉津的灭菌土壤；生物强化（Bioaugmentation）代表接种AT-5菌株的加标阿特拉津的土壤；以trzN的基因拷贝代表trzN的定量结果（g -1 干燥土壤）。
通过qRT-PCR的方法，我们通过定量初始水解酶基因 trzN 的拷贝数，计算了土壤中接种的AT-5菌株的丰度（图1）。PCR阈值标准曲线扩增效率为98.4%。在生物强化处理中， trzN 基因的拷贝数在前7天内下降，随后保持相对稳定直至培养结束（14 d），而 trzN 基因不能用未经任何处理的原始土壤样本中提取的DNA模板进行扩增。说明 接种AT-5菌株在土壤中能很好地存活一段时间 （14d）。
土壤中高、低浓度的阿特拉津均对甘薯幼苗能够顾产生药害效果（补充图S2）。在21 d栽培期内，尽管甘薯幼苗能在低浓度阿特拉津（0.2mg kg -1 ）存在的土壤中存活，但仍可观察到药害现象，诸如叶片发黄等。这表明甘薯幼苗对阿特拉津敏感，即使低浓度的阿特拉津残留在土壤中，也会影响后续作物的种植。因此，我们在加标阿特拉津的处理14 d的剩余土壤样本（Atr）以及加标阿特拉津且接种AT-5菌株的处理14 d的剩余土壤样本（Atr-Bio）中再次种植甘薯幼苗。此时，Atr和Atr-Bio土壤中残留的阿特拉津浓度分别为3.36 ± 0.62和0.09 ± 0.002 mg kg -1 。阿特拉津加标土壤（Atr）对甘薯幼苗造成严重的药害效应，甘薯幼苗在培养21 d后死亡。而甘薯幼苗在加标阿特拉津且接种了AT-5菌株的土壤中生长良好（Atr-Bio；图2）。这些结果进一步表明， AT-5菌株的生物强化可有效去除土壤中的阿特拉津，并可防止阿特拉津残留对后续作物的损害。
图2 通过生物强化减轻了阿特拉津对甘薯幼苗的药害。 对照（Control）代表培养14天后的加标阿特拉津的原始土壤，该土壤个样本中阿特拉津的浓度为3.36 ± 0.62 mg kg -1 。生物强化（Bioaugmentation）：培养14天后的加标阿特拉津且接种了AT-5菌株的土壤，该土壤样本中阿特拉津的残留浓度为0.09 ± 0.002 mg kg -1 ，每个处理设3个重复。
通过16S rRNA-扩增子测序，我们进一步探讨了不同处理下的土壤样本在第0、1、3、7以及14 d时土壤细菌群落的变化情况。在α-多样性方面，与Atr-Bio处理（接种AT-5菌株的阿特拉津土壤）和Bio处理（接种AT-5菌株的原始土壤）相比，对照处理（甲醇和ddH 2 O处理）表现出更高的群落丰富度（表现为较高的Chao1指数和OTU数量）和多样性（表现为较高的Shannon指数和Simpson指数）（图3）。此外，未接种AT-5菌株但引入了阿特拉津的处理组（Atr处理）降低了土壤群落丰富度，而对群落多样性影响不大（图3）。说明 接种降解菌AT-5菌株显著影响了土壤中细菌群落的丰富度和多样性。
基于主坐标分析（PCoA）和层次聚类分析，我们进一步探究了AT-5菌株的接种和阿特拉津的引入对土壤细菌群落的影响。根据不同的处理和时间，我们将土壤样品分为两个不同的集群：接种处理（Atr-Bio和Bio）和非接种处理（Control和Atr；图4A）。此外，通过分层聚类分析我们也发现了土壤样本之间存在明显的分离，其表现为接种处理和其他处理之间较大的距离（补充图S5）。这些结果表明， 接种AT-5菌株主导了土壤中细菌群落多样性和结构的变化，而阿特拉津的引入对细菌群落几乎没有影响。
图3 细菌群落的丰富度和多样性指数。 （A）代表菌株AT-5的相对丰度；（B）代表本研究所观察到的OTU数量；（C）代表Chao1指数；（D）代表Shannon指数；（E）代表Simpson指数。对照代表向原始土壤中加入等量甲醇和ddH 2 O；Atr代表加标阿特拉津的原始土壤；Atr-Bio代表加标阿特拉津且接种了AT-5菌株的土壤；Bio代表加标AT-5菌株的原始土壤。
图4 不同处理对土壤细菌群落结构的影响。 （A）以基于Bray-Curtis距离对土壤细菌群落进行的主坐标分析（PCoA）；（B）代表不同土壤样本中，在门水平上上细菌相对丰度的分层聚类分析。对照代表向原始土壤中加入等量甲醇和ddH 2 O；Atr代表加标阿特拉津的原始土壤；Atr-Bio代表加标阿特拉津且接种了AT-5菌株的土壤；Bio代表加标AT-5菌株的原始土壤。
在所有处理中，丰度较高的细菌门包括放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）和拟杆菌门（Bacteroidota）（图4B）；在属水平上， Paenarthrobacter 、 Pseudarthrobacter 和类诺卡氏菌属（ Nocardioides ）是主要优势细菌属（补充图S6）。其中， Paenarthrobacter 属是接种处理组中的主要优势属，其丰度在Atr-Bio处理中保持相对稳定（1、3、7、14 d分别为21.1%、15.3%、13.0%、17.9%）。这些结果结合qRT-PCR数据显示， 本研究所接种的 Paenarthrobacter sp. AT-5菌株在土壤中稳定存活 （图1，3A；补充图S6）。
为了确定区分不同处理的生物标志物，基于LEfSe分析（补充图S7），我们在所有水平上共检测到58种潜在的生物标志物。在属水平（图5A）， Paenarthrobacter 和芽孢杆菌属（ Bacillus ）是Bio和Atr-Bio处理（接种处理）中的潜在生物标志物。此外， 接种处理中芽孢杆菌的丰度显著增加，表明接种 Paenarthrobacter sp. AT-5菌株在土著微生物群中富集了芽孢杆菌属。 同时，与其他处理相比，在接种处理中，包括 Marmoricola 、类诺卡氏菌属、壤霉菌属（ Agromyces ）和 Solirubrobacter 在内的17种其他潜在生物标志物的相对丰度降低。这些结果表明，接种处理在土著微生物群的选择中对这些菌属进行了负选择。值得注意的是，包括 Marmoricola 、类诺卡氏菌属、壤霉菌属和 Solirubrobacter 在内的生物标志物，仅在14天时，在加标阿特拉津处理的土壤（Atr）中被检测到。与第1、3和7天相比，这些细菌属的丰度第14天的Atr处理组中显著增加。这表明，这4个属可能是非接种处理中阿特拉津降解的阳性生物标志物。
图5 以热图的形式展示了不同处理组在属水平（A）和科（B）水平上对差异丰度细菌的LEfSe分析。 对照代表向原始土壤中加入等量甲醇和ddH 2 O；Atr代表加标阿特拉津的原始土壤；Atr-Bio代表加标阿特拉津且接种了AT-5菌株的土壤；Bio代表加标AT-5菌株的原始土壤。Atr-Bio_Bio代表Atr-Bio处理与Bio处理的比较，Control_Atr代表对照组与Atr处理的比较。0-5天代表早期；7-14天代表晚期。
通过构建细菌共生网络，我们对不同处理组（Control、Atr、Bio和Atr-Bio）中细菌群落的共生模式进行了分析。Atr-Bio和Atr网络之间共生模式的拓扑性质差异显著（图6）。 与其他处理组的共生网络相比，Atr网络表现出更多的节点和边缘，更高的平均度和平均聚类系数，以及更高的密度和连通性，这表明Atr网络比Atr-Bio网络具有更大的复杂性和连通性 （补充图S8）。此外，正相关在所有网络中占据主导地位，这与不同的处理无关。然而，与Atr处理（10.2%）相比，Bio（5.9%）和Atr-Bio（3.5%）处理所构建的网络中的负相关显著降低。Atr网络中较高的负相关性可能归因于阿特拉津引入对非适应性细菌的过滤。在Atr-Bio网络中，较低的负相关性可能归因于生物强化去除了阿特拉津，并恢复了细菌群落。
图6 不同处理条件下的细菌共现网络。 （A）代表对照处理（向原始土壤中加入等量甲醇和ddH 2 O）；（B）代表Atr处理（加标阿特拉津的原始土壤）；（C）代表Bio处理（接种AT-5菌株的阿特拉津加标土壤）；（D）代表Atr-Bio处理（接种AT-5菌株的天然土壤）。
讨论
自然环境中的微生物群落通常没有降解有机污染物的能力。 生物强化是一种接种特定功能的微生物用于降解污染物的策略，已被提出作为清理污染物污染场所最有潜力的方法。 尽管已有的研究探究了阿特拉津降解菌株对阿特拉津污染场地的生物强化作用，但关于生物强化对土著土壤微生物群落影响的研究很少。尽管如此，外源菌株的接种可能会显著改变土壤微生物群的结构，影响其潜在功能。为了确定生物强化是否具有负环境效应，需要对接种的外源菌株、污染物和土壤微生物之间的相互作用进行研究。本研究通过接种 Paenarthrobacter sp. AT-5菌株对阿特拉津进行去除，以探讨生物强化对土壤微生物群的影响及微生物群落的重建过程。
在本研究中， AT-5菌株的生物强化处理对阿特拉津的去除率在7天时达到95.9% ，先前的研究曾表明，在节杆菌属HB-5菌株处理的阿特拉津污染的土壤中，阿特拉津在土壤中的半衰期显著降低至6.3天，结合我们的研究结果表明， AT-5菌株在土壤中具有极好的阿特拉津降解潜力。 此外，成功的生物强化不仅依赖于接种物的降解性，还依赖于其在环境中存活的能力。一些研究证明，接种物在环境中的持续存在是生物强化的关键因素。我们前期研究表明，接种的外源降解菌株在土壤中不能很好地存活，导致毒死蜱矿化率的下降。通过qRT-PCR和16S rRNA-扩增子测序，我们发现接种的 AT-5菌株在土壤中存活良好，并在14天的培养期内保持相对稳定，这保证了其对阿特拉津污染土壤的有效降解效率 。此外，生物修复往往受到环境的限制，如土壤类型等。而 AT-5菌株在包括中国济宁、廊坊、徐州等在内的多地区采集的不同土壤中表现出良好的修复效果 （补充图S3、S4），这表明 AT-5菌株对阿特拉津污染的不同类型的土壤具有很大的修复潜力。
本研究中，放线菌门和变形菌门是所有处理组中最丰富的细菌门。以往的研究发现，变形菌门由于对污染物具有良好的耐受性，是各种农药污染土壤中的优势微生物。此外，在放线菌门和变形菌门中发现了几种阿特拉津降解细菌，如节杆菌属 Paenarthrobacter 、假单胞菌属（ Pseudomonas ）和诺卡氏菌属。与对照处理相比， 接种处理中芽孢杆菌的丰度显著增加，表明潜在的土著芽孢杆菌可能直接或间接参与了阿特拉津的降解。 到目前为止，已报道几种芽孢杆菌，如地衣芽孢杆菌ATLJ-5（ Bacillus licheniformis ATLJ-5）、巨大芽孢杆菌ATLJ-11（ Bacillus megaterium ATLJ-11）和枯草芽孢杆菌HB-6（ Bacillus subtilis HB-6）均能够降解阿特拉津及其代谢物。因此， 加入阿特拉津增加了潜在生物标志物（如芽孢杆菌）的相对丰度，其可能参与阿特拉津或其代谢物的生物降解过程。
接种处理中的细菌丰富度和多样性显著下降，在受啶虫脒污染的土壤中接种 Pigmentiphaga sp. D-2菌株以进行生物强化过程的研究中也观察到这一现象。本研究中观察到的这种现象可归因于AT-5菌株的持续存在和生态位占据。此外，接种AT-5菌株可增强阿特拉津的降解、中间产物的产生以及土壤中的养分消耗。这些土壤微环境的这些变化也可能导致细菌丰富度和多样性的显著降低。而对照处理（施加甲醇和ddH 2 O）和Atr处理（施加阿特拉津）下的土壤样本的丰富度和多样性指数并未引起显著的变化。这些结果表明， 本研究所接种的AT-5菌株主导了土壤细菌群落结构的变化。 有研究表明，接种物在消除掉土壤中的污染物后其丰度会降低。考虑到土壤中复杂环境因素的影响以及接种物与土著微生物之间的竞争，我们推测菌株AT-5在消除阿特拉津后可能无法在原位土壤中保持较高的丰度。但本研究目前尚未在更长的时间尺度上收集Atr-Bio处理的土壤样本。因此，在今后的研究中需要明确菌株AT-5在土壤中的最终命运。
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