科研 | Nature子刊（IF：17）：高覆盖代谢组学揭示微生物驱动的小鼠器官间运输和肠-脑联系的生化景观

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编译：微科盟 北岸 ，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

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导读

哺乳动物的肠道有一个复杂而动态的微生物生态系统：微生物群。虽然新兴研究支持微生物群通过一些代谢通路调节大脑功能，但“微生物群-肠-脑轴”的整体生化景观仍不清楚。在本研究中，研究人员使用高覆盖率代谢组学对无菌C57BL/6小鼠及与之年龄相等的常规饲养小鼠的粪便、血清和大脑皮质组织进行比较分析。结果显示， 由于微生物群的影响，这三种基质的代谢组特征产生了数百种确定的代谢物，包括粪便有533种改变的代谢物、血清有231种改变的代谢物和大脑有58种改变的代谢物，这些代谢物具有许多涉及芳香族氨基酸和神经递质的显著富集途径 。多重比较分析挑出微生物群衍生的代谢物，这些代谢物可能与组织间转运和肠-脑轴有关，例如硫酸吲哚酚和三甲胺-N-氧化物。讨论了性别间的代谢物特征。研究人员的发现可能对未来探索微生物对宿主代谢和肠道-大脑联系的影响有重要的价值 。

论文ID

原 名： High-coverage metabolomics uncovers microbiota-driven biochemical landscape of interorgan transport and gut-brain communication in mice

译 名 ： 高覆盖代谢组学揭示微生物驱动的小鼠器官间运输和肠-脑联系的生化景观

期刊 ： NATURE COMMUNICATIONS

IF： 17.694

发表时间： 2021.10

通讯作 者： Kun Lu

通讯作者单位： 美国北卡罗来纳大学教堂山分校

DOI号： 10.1038/s41467-021-26209-8

实验设计

结果

1 比较GF和 CONV-R 小鼠的高覆盖代谢组学

为了根据肠-脑信号揭示微生物群-宿主相互作用的代谢产物，研究人员对12只GF和12只CONV-R C57BL/6小鼠（8周龄）的粪便、血清和脑组织（大脑皮层切片）进行了代谢组学研究，包括靶向和非靶向代谢组学（图1a）。使用UHPLC-HESI-HRMS，研究人员根据MS1全扫描数据检测并将每种样本类型的离子特征对齐到主峰表中，生成的离子特征总数范围为粪便（加热ESI+）的最高值17,386—脑组织（加热ESI+）的最低值6334（图1b）。研究人员对这些表格进行了统计评估，以筛选GF/CONVR差异的特征（倍数变化 ≥ 1.5， p  值 < 0.01, Welch’s t检验）（图1b, c），共得出20,939个显著离子特征，其中粪便为16,001个，血清为3,977个，脑组织为961个。 研究人员获得了所有代谢特征的串联质谱，并结合靶向和非靶向注释的化学信息管道实现了可能的最高代谢组覆盖率 （图1a，附图1）。目标程序与包含保留时间、准确质量和MS2特征片段的内部光谱库相匹配，该光谱库包括423个标准途径代谢物的真实化学标准和46个文献报道的包括神经递质在内的微生物副产物（补充数据1）。同时，无目标分析需要验证的规则和工具，用于公式生成、结构复制和基于机器学习的保留时间预测。研究人员对这两种方法的鉴定结果进行了人工筛选和合并，得出了533种粪便代谢物、231种血清代谢物和58种1级确定结构或2级可能结构的代谢物（图1d；补充数据2和4）。

图1 实验方法和多代谢组学分析综述。a 实验流程从8周龄匹配无菌小鼠（GF, N = 12）和常规饲养（CONV-R）特异性无病原体C57BL/6小鼠（N = 12）的粪便、血液血清和大脑皮层脑组织的样品采集和代谢物提取开始。采用了一种新颖的高覆盖代谢组学方法，包括轨道阱高分辨率质谱、基于内部质谱库的靶向注释、使用流线化学信息学管道进行重新结构复制的非靶向注释、单变量和多变量统计以及数据可视化。b 总离子特征数和显著离子特征数（p值 < 0.01，倍数变化 ≥ 1.5，在HESI阳性和阴性分析模式下，检测粪便、血清和皮质脑组织的双边Welch’s t检验）。c 趋势分布的离子特征明显改变。d 三种样品基质中所有已鉴定的GF/ CONV-R代谢物差异的维恩图。色度色谱法、HESI（加热电喷雾离子化）、PRM（平行反应监测）、QA/QC（质量保证/质量控制）、ISD（内标）、PCA（主成分分析）、RT/mz（文库保留时间和质荷比对库）、ExpDB（实验数据库）、MoNA（北美MassBank数据库）和GNPS（全球天然产物社会分子网络）。

2 微生物是胃肠代谢的主要调节者

由于肠道是共生微生物的最大生态位，并容纳了消化、稳态和免疫的最关键部位，肠道代谢组代表了探索微生物-宿主相互作用的独特途径。如主成分分析（PCA）（图2a，b）和代谢组总离子色谱云图（图2c）所示，研究人员的代谢组学显示了微生物群引起的不同粪便模式。16,001个不同的粪便特征占检测总数的49.0%。高覆盖率化学信息成功地从这些特征中分离出533种粪便代谢物。

为了获得“景观”视图，进行了化学相似富集分析（ChemRICH）。聚类的化学类有70个，亲脂性范围广，化合物数（节点大小）和变化趋势（节点颜色）各不相同；节点的色谱中，红色表示在GF/ CONV-R差异代谢物中，富含GF的代谢物数量超过了CONV-R中增加的代谢物和/或总体上包含更大的倍数变化（图2d；补充数据5、6）。最显著富集的是胆酸、寡肽、谷氨酸、吲哚和核苷，其次是其他氨基酸（如硫、芳香族）、脂类（如酰基肉碱、脂肪酸）和包括牛磺酸和儿茶酚胺在内的神经递质家族。为了在生物途径的背景下进行解释，研究人员基于小分子途径数据库（SMPDB）中99组预先定义的代谢物进行了定量代谢物富集分析（qMSEA）。研究人员在胃肠道中鉴定了71条微生物调节的途径（校正 p  < 0.05）（补充数据7），其中前50条如图所示（图2e）。该分析富集了嘌呤、色氨酸代谢、胆酸生物合成、卟啉代谢和脂肪酸代谢，以及其他氨基酸（如精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸和支链氨基酸）、脂质代谢（如磷脂、肉碱和性类固醇激素）、辅助因子（如维生素K、维生素B5、生物素、维生素B3和维生素B6）和多胺代谢（如亚精胺）等。这两项分析均证实微生物群是肠道代谢的主要调节因子，包括蛋白质代谢（改变了100多个寡肽）、能量获取（如脂肪酸β-氧化、肉碱穿梭、柠檬酸循环和糖异生）以及许多涉及氨基酸和脂质作为底物或配体的信号通路。

研究人员转向单个粪便代谢物并选择路径进行深入分析。使用随机森林模型，改变的粪便代谢物根据它们对分组分离的相对贡献进行排名，前50名显示在重要变量图（VIP）中（图3a）。 排名靠前的代谢物在结构上是多样化的，表明了微生物组-代谢组网络的多面性和复杂性。 研究人员特别关注芳香族氨基酸途径，因为它们证实了微生物参与和神经调节活动，富含色氨酸的代谢是第二重要的（图2e），代表了主要化合物类别（除了能量收获和蛋白质代谢的化合物类别）（图2d），包括在随机森林分类模型中高度排名的多个代谢物成员，包括犬尿氨酸（第4位）、莽草酸酯（第12位）和血清素（第21位）（图3a）。综合来看（图3b），当微生物群存在时，所有三种色氨酸分解代谢通量均增强，其特征是：（i）色氨酸池减少（1.4倍），（ii）犬尿氨酸、5-羟基-L-色氨酸和吲哚水平降低，以及（iii）5-羟色胺（5-HT）（5.7倍）、犬尿氨酸（4.1倍），1.8-36.3倍变化的吲哚衍生物，包括吲哚-3-丙酸（IPA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-乳酸（ILA）和吲哚-3-羧醛（I3A）（图3b，c）。研究人员还观察到明显的胆汁酸模式，倍数变化高达三个数量级（图3d；补充数据2）。注意，CONV-R粪便中的游离形式初级胆汁酸，如鹅脱氧胆酸盐、胆酸、鼠胆酸（αMCA+βMCA）明显较高，而其牛磺酸或甘氨酸结合物的趋势相反。相应地，发现CONV-R粪便中的次生胆汁酸比GF中的要丰富得多（图3d；补充数据2）。

图2 由于微生物群的存在，不同的粪便代谢组特征。a主成分分析图和b比较GF （N = 12）和CONV-R小鼠（N = 12）在加热ESI+模式下的粪便代谢组学数据。c 组间粪便中重要离子特征的代谢组总离子色谱云图（ p 值 < 0.01，倍数变化 ≥ 1.5，以加热ESI+数据为例进行双边Welch’s t检验；较大的圆圈尺寸表示较大的倍数变化值，范围从1.5到5300.6。d化学相似性富集分析（ChemRICH）根据Kolmogorov–Smirnov检验，对533个经鉴定的改变粪便代谢物进行聚类，聚类结果为x轴调解对数加性辛醇-水分配系数（XlogP）和y轴集合统计显著性；节点大小表示每个簇集的总化合物数量，节点颜色表示富含GF和富含CONV-R的代谢物的比例。e定量代谢物集富集分析（qMSEA）基于99组预先定义的代谢物，确定了总共71条显著相关的粪便代谢途径（调整后的 p <0.05），显示了前50条。Dim（维度）、LC/MS（液相色谱-质谱）、TIC（总离子色谱）、TriHOME（三羟基十八烯酸）、FA（脂肪酸）、HODE（二烯酸）、CoA（辅酶A）。

图3 选择受微生物调节的高影响肠道代谢物和途径。a 前50名粪便代谢物（y轴）的可变重要性图，根据随机森林模型中Gini系数（x轴）的平均下降精度进行排序，以识别群体差异。b 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和代谢受粪便介导的途径，其中标记为红色（GF > CONV-R）或蓝色（GF < CONV-R）的代谢物显著改变（双边Welch’s t检验，倍数变化 ≥ 1.5， p   < 0.01）。c、 d由微生物群合成或介导的粪便吲哚（c）和胆汁酸（d）的箱形图（GF，N = 12；CONV-R，N = 12），* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001，双边Welch’s t检验；补充数据2中提供了精确的p值和校正后的p值（即q值）。SM（鞘磷脂）、Phe（L-苯丙氨酸）、Tyr （L-酪氨酸）、Trp （L-色氨酸）、5-HT （5-羟色胺）、NAS （N-乙酰血清素）、5-MIAA （5-甲氧基吲哚-3-乙酸）、Kyna（犬尿喹啉酸羟化酶）、Kyn（L-犬尿氨酸）、AA（氨基苯甲酸酯）、XA（黄脲酸）、IAA（吲哚-3-乙酸）、IPA（吲哚-3-丙酸）、ILA（吲哚-3-乳酸）、I3A（吲哚-3-羧醛）、L-DOPA（左旋多巴L-3,4-二羟基苯丙氨酸）、DHICA （5,6-二羟基吲哚-2-羧酸盐）、CDCA（鹅脱氧胆酸盐）、CA（胆酸盐）、αMCA（α-鼠胆酸盐）、TCDCA（牛磺酰脱氧胆酸盐）、TCA（牛磺胆酸盐）、TαMCA（牛磺酰α-鼠胆酸盐）、DCA（脱氧胆酸盐）、HDCA（猪去氧胆酸甲酯）、LCA（石胆酸盐）。

3 微生物广泛地介导肠道神经递质的产生和转化

共生微生物群包含无数神经递质产生者，这一发现最近引发了令人兴奋的假说问题，关于它们对宿主神经递质、肠脑信号和心理健康结果的影响。在此，研究人员对GF和CONV-R小鼠的粪便神经递质进行了全面分析。如选择性所示（图4a - d），研究人员发现在微生物群存在的情况下，许多神经递质的水平显著升高，跨越a类（类视紫红质）G蛋白偶联受体途径（GPCR）胺，包括乙酰胆碱、肾上腺素、组胺、血清素和酪胺（图4a），C类代谢性神经递质L-谷氨酸和GABA（图4b）与其他通道或受体的神经递质（或其前体），例如牛磺酸、L-高胱氨酸、L-3,4-二氢苯丙氨酸（L-DOPA）（图4c）。许多神经递质在GF粪便中几乎不存在，峰值强度低至检测限，即使在研究人员的超灵敏质谱分析中也是如此。这表明， 肠道微生物群对神经递质的产生起着至关重要的作用。一些神经内分泌信号分子，即甘氨酸、皮质醇、腺苷和2-氨基己二酸，呈现出相反的趋势 （图4d），这表明是内源性来源而非微生物群的影响。

研究人员专门研究了两种主要的神经递质途径，即儿茶酚胺生物合成（图4e）和谷氨酰胺/谷氨酸GABA循环（图4f），因为这两种途径最近都被认为是微生物调节从胃肠道延伸到全身的宿主神经递质的潜在途径。儿茶酚胺，即多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素，是生物胺神经递质，在运动、大脑奖励机制和快乐调节中具有重要功能。与之前的数据一致，研究人员的结果显示粪便中去甲肾上腺素（2.9倍）、肾上腺素（3.2倍）以及两种多巴胺前体酪胺（5.7倍）和左旋多巴（4.7倍）的水平显著升高。尽管粪便中的多巴胺水平没有统计学差异，但发现，当存在微生物群时， 两种相关的硫酸盐结合物（多巴胺-3-O-硫酸盐和多巴胺-4-硫酸盐）显著升高 （图4e）， 值得进一步分析 。谷氨酰胺/谷氨酸GABA代谢与三羧酸（TCA）循环发生了很大变化，在肠道内也受到调节，表现为 随着微生物群的存在L-谷氨酰胺（2.3倍）减少，L-谷氨酸（2.5倍）和GABA（6.8倍）增加 （图4f）。

出乎意料的是，研究人员观察到一种共轭化合物由于微生物群而发生改变，包括葡萄糖醛酸和神经递质的硫酸盐（图4g）。研究人员构建了它们的热图，其中28种在CONV-R 粪便中富集，5种相反（图4g）。基于广泛的文献搜索，研究人员突出了具有神经调节特性的化合物，包括11种化合物（例如，n -乙酰羟色胺葡萄糖醛酸）和3种化合物（例如，多巴胺4-硫酸盐），当微生物群存在时，以及膳食衍生类黄酮的其他结合物（例如，染料木素4’-o-葡萄糖醛酸），胆汁酸（例如，牛磺胆酸3-硫酸盐）和吲哚衍生物（例如，吲哚-3-羧酸-O-硫酸盐，吲哚-3-乙酸-O-葡萄糖醛酸）（图4g）。这些数据共同支持 目前的微生物群在局部肠腔的神经递质代谢物质在生产、转化和生物利用度方面起着不可或缺的作用，这为今后以时间和空间特定的方式描述微生物在种分类水平的贡献提供了依据。

图4 微生物群广泛介导胃肠道神经递质的产生、解偶联和转。a–d 粪便A类（类视紫红质）GPCR胺类神经递质（a）、粪便C类代谢性神经递质L-谷氨酸和GABA（b）、CONV-R小鼠富集的神经递质和相关分子（c）以及富含GF的神经递质和相关分子（d）的箱型图（GF，N=12；CONV-R，N=12），* p   < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001，**** p   <0 .0001，双边Welch’s t检验；补充数据2中提供了精确的 p 值和校正后的 p 值（即 q 值）。（e）微生物群引起的粪便中儿茶酚胺生物合成途径改变的示意图摘要，代谢产物显著改变，标记为红色（GF > CONV-R）或蓝色（GF < CONV-R）（双边Welch’s t检验，倍数变化 ≥ 1.5， p < 0.01）。f图总结了由于微生物群引起的粪便（谷氨酰胺-）谷氨酸GABA代谢改变与柠檬酸循环的耦合，以及标记为红色（GF > CONV-R）或蓝色（GF < CONV-R）的显著改变的代谢物（Welch’s t检验，倍数变化 ≥ 1.5， p  < 0.01）。g第二阶段反应中不同粪便代谢物的热图聚类；神经递质或相关化合物的葡萄糖醛酸盐或硫酸盐用粗体文字标记，并用星号表示统计意义。GABA（γ-氨基丁酸）、5-HTP （5-羟基-L-色氨酸）、5-HT（5-羟色胺）、5-HIAA （5-羟基吲哚乙酸）、PLA （DL-3-羟基苯乳酸）、HPLA （DL-p-羟基苯乳酸）、DOPEG （3,4-二羟基苯二醇）、MOPEG （3-甲氧基-4-羟基苯二醇）、MAO（单胺氧化酶）、CYP2D6（细胞色素P450 2D6）、COMT（儿茶酚-O-甲基转移酶）、TCA循环（三羧酸循环）、Gln/Glu-GABA代谢（谷氨酰胺/谷氨酸-γ-氨基丁酸代谢）、AKGα（酮戊二酸）、L-Asp（L-天冬酰胺）、L-Ala、L-丙氨酸、GS/GOGAT循环（谷氨酰胺合成酶/谷氨酸：2-氧谷氨酸转氨酶循环、Gly（L-甘氨酸）、GABA-T（4-氨基丁酸转氨酶）、GAD（谷氨酸脱羧酶）。

4 微生物对血液循环代谢和粪血交换的影响

随着微生物群对肠道代谢和神经递质分布控制的揭示，这些局部效应是否会从肠道传播到周围器官的问题也随之产生。为了研究这一点，研究人员分析了GF和CONV-R小鼠的循环血清。研究人员观察到由于微生物群引起的血清代谢组的系统性扰动，尽管不如粪便数据那么显著（图5a-c），但检测到3977个显著的离子特征，占总离子特征的21.0%，与微生物群对肠道代谢和神经递质谱的结果一致。研究人员成功地从这些改变的特征中分辨出231个独特的结构（补充数据3）。

研究人员进行了化学相似性富集和定量途径富集分析。ChemRICH 图将血清代谢物分为27个化学类别，包括肉碱、二肽、吲哚以及脂质、氨基酸和有机酸（图5d；补充数据8、9）。研究人员发现， 在231种代谢产物中，有175种（75.8%）在存在微生物群的情况下被下调，这也表现为普遍的紫色到红色 （图5d）。qMSEA分析显示 循环血液中有61条显著富集的途径 （校正 p < 0.05）（补充数据10），显示前50条（图5e）。根据粪便数据，富集的Top血清途径从卟啉代谢、酮体代谢、胆汁酸生物合成到多种氨基酸代谢，包括芳香族氨基酸家族（图5e）。结果表明， 微生物群具有全身效应，可调节外周血循环，通过体内分子线索的体液转运增加了微生物群-肠-脑轴的可能性。

与粪便数据类似，研究人员关注个体血清代谢物进行深入分析，以描绘潜在的血液网络和神经内分泌途径。随机森林分析根据对组分离的贡献对所有改变的231种血清代谢物进行排序，显示前50名（图6a）。除了用于能量过程的代谢物（例如，酰基鸟嘌呤、寡肽、酮体），研究人员还注意到血清中的微生物产物。例如，排名靠前的4-乙基苯酚是由细菌合成的已知酪氨酸代谢物。苯硫酸盐在CONV-R血清中的水平飙升（173.33倍），排名第三，是一种经证实的肠道微生物群衍生的尿毒症毒素，可导致糖尿病肾病的蛋白尿（图6a；补充数据3）。另一种酚类衍生物N-（2-苯乙酰基）甘氨酸（PAG）在微生物群中上升了10.5倍，排名第五。在VIP图表中，研究人员还观察到几种色氨酸吲哚衍生物在CONV-R血清中富集。其中包括硫酸吲哚（4351.6倍）、IPA（7.3倍）、吲哚-3-乙酸甲酯（4.3倍）以及其他吲哚（附图2a）。这些结果共同支持 微生物群对宿主的系统性影响涉及微生物分子的体液转运。

为了揭示微生物群-血清代谢组网络，研究人员将重点放在芳香族氨基酸途径（图6b）上，在VIP图表（图6a）上有多个高含量的酚类和吲哚。与粪便数据（图3b）相比，研究人员观察到CONV-R血清总体上具有一致的模式，例如色氨酸分解代谢通量增加，具有犬尿氨酸减少和吲哚富集的特点。有趣的是，研究人员注意到血清5-羟色胺水平虽然处于高峰值强度（区域，10 ⁸ ），但在CONV-R和GF小鼠之间没有统计学差异，这与阐明微生物群调节外周血清素水平的研究相冲突。研究人员重新评估了数据，发现雄性CONV-R小鼠的血清5-羟色胺水平明显高于雄性GF小鼠（ p   = 0.0022，成对Wilcoxon秩和检验，CONV-R/GF倍数变化为1.6），而雌性小鼠没有表现出统计差异（ p = 0.18）（附图2b），表明 性别是肠道微生物影响哺乳动物循环血清素水平的一个潜在因素 。研究人员还检查了血清神经递质和神经调节化合物（附图2c），并注意到甘氨酸、皮质醇和2-氨基己二酸与粪便数据具有相似的趋势（在CONV-R小鼠中减少）。而组胺和GABA呈相反趋势，CONV-R的水平明显低于GF血清。令人惊讶的是，CONV-R肠道富含的神经递质，如乙酰胆碱、肾上腺素和牛磺酸，要么低于血清中的检测水平，要么在各组之间无统计学差异。这些结果共同表明， 微生物群对外周循环神经递质的调节是严格划分的。

为了进一步描述肠道-血液交换，研究人员重点研究了粪便和血清基质共有的GF/CONV-R差异代谢物。总共有88个代谢物对显示在MetaMapp网络图中，用于并列比较（图6c，d）。网络分析产生了九个化合物簇，包括脂肪酸、氨基酸和肉碱/胆碱。血清中的总体变化小于粪便中的总体变化，如Welch’s t检验中通常较小的节点和较大的校正 p 值所示（图6c，d）。研究人员注意到， 脂肪酸对，包括微生物群衍生的己二酸和癸二酸，具有相反的肠道血液模式，其中20种在粪便中升高，但在含有微生物群的小鼠的血清中降低。 相反，对于CONV-R小鼠，酚类物质如羟基苯乳酸和4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯在粪便中含量较低，但在血清中含量较高。除这两种化合物外，其他化合物类显示出类似的粪便血液变化模式，包括氨基酸衍生物（包括吲哚）、核苷酸、类固醇和肉碱/胆碱。结果支持微生物群对局部肠道上皮内稳态、能量收集和信号传导的影响可以转移和传播到外周血循环，进一步提高体液转运的可能性和对宿主中枢神经系统（CNS）的影响。

图5 微生物群对宿主循环血液代谢的全局影响。a，b在加热ESI+模式下，比较GF（N=12）和CONV-R小鼠（N=12）的血清代谢数据的主成分分析图（a）和scree负荷图（b）。c组间血清显著特征的代谢总离子色谱云图（ p 值 < 0.01，倍数变化 ≥ 1.5，以加热ESI+为例进行双边Welch’s t检验；节点尺寸越大，表示1.5-1347.1之间的倍数变化值越大。d化学相似性富集分析（ChemRICH）对231种经鉴定的改变血清代谢物进行聚类分析，根据Kolmogorov–Smirnov检验，通过与x轴调解对数加性辛醇-水分配系数（XlogP）和y轴的化学相似性对集合进行统计显著性分析；节点大小表示每个簇集的总化合物数量，节点颜色表示富含GF和富含CONV-R的代谢物的比例。e定量代谢物组富集分析（qMSEA）基于99组预先定义的代谢物，确定了总共57条差异显著的血清代谢途径（调整后的 p   < 0.05），显示了前50条。LC/MS（液相色谱-质谱）、TIC（总离子色谱）、HETE （5-羟基二十碳四烯酸）、FA（脂肪酸）。

图6 选择高影响的代谢产物和循环血液及其肝肠运输途径。前50名血清代谢物（y轴）的可变重要性图，根据随机森林模型中基尼系数（x轴）的平均下降精度进行排序，以识别组间差异。（b）总结苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和代谢的影响血清途径。c，d粪便（c）和血清（d）中88个代谢物对的MetaMapp代谢组学网络发生改变，节点代表单个代谢物，边缘为生化（KEGG反应物对）和化学（Tanimoto系数 > 0.7）关系，较低的透明度为较低的校正p值（< 0.05，双边Welch’s t检验）。TMAO（三甲胺N-氧化物）、PS（磷脂酰丝氨酸）、Phe（L-苯丙氨酸）、Tyr（L-酪氨酸）、Trp （L-色氨酸）、, Kyn（L-犬尿氨酸）、, AA（氨基苯甲酸酯）、IAA（吲哚-3-乙酸）、IPA（吲哚-3-丙酸）、ILA（吲哚-3-乳酸）、IArcA（吲哚-3-丙烯酸酯）、I3A（吲哚-3-羧醛）、Shikimate（3-莽草酸3-磷酸）、DHICA （05,6-二羟基吲哚-2-羧酸），AKG（α-酮戊二酸），L-DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸），SULT（硫转移酶），CYP450（细胞色素450），TCA（循环三羧酸循环）。

5 大脑皮质、粪便和血清代谢组的综合分析

为了进一步确定共生微生物群是否调节大脑生物化学代谢，研究人员比较了GF和CONV-R小鼠大脑皮层的代谢组。研究人员将重点放在大脑皮层区域，因为它是神经整合的最大场所（占哺乳动物大脑质量的三分之二以上），在大脑功能中起着关键作用，如思维、记忆、语言和意识，重要的是，大脑皮层损伤通常与精神障碍的发作有关，如抑郁症，其中许多也是肠道失调的常见共病。总的来说，研究人员在大脑皮质组织中发现了改变的代谢物（补充数据4）。为了解释这些，研究人员构建了所有代谢物的网络图，并根据随机森林模型对其进行了排序（图7a）。 该网络显示了多种化合物的变化，如吲哚、氨基酸、核苷酸和脂肪酸。 在VIP图上，研究人员发现了一系列与氧化应激和活性氧（ROS）反应相关的标记物和途径。例如，蛋氨酸/谷胱甘肽转硫途径在大脑中受到广泛干扰，当存在微生物群时，其特征是L-蛋氨酸（1.47倍）、S-（5’-腺苷）-L-同型半胱氨酸（SAH，1.30倍）、L-谷胱甘肽（GSH，15.1倍）和5’-脱氧-5’-甲基硫代腺苷（1.62倍）水平升高（附图3）39,40。研究人员还注意到CONV-R大脑中两种二十烷酸前列腺素B2（1.8倍）和E2（1.7倍）、α-酮戊二酸（AKG，1.4倍）（一种敏感的氧化应激指标）以及抗氧化酮体3-羟基丁酸（2.0倍）的水平升高。除了通用标记外，研究人员还发现了一系列与氧化还原稳态有关的微生物衍生代谢物。与GF小鼠相比，短链脂肪酸（例如丁酸、己酸）、吲哚（例如，吲哚硫酸酯、吲哚-3-乳酸）、三甲胺-N-氧化物（TMAO）、莽草酸和苯丙氨酸衍生物（例如，羟基苯乳酸、PAG）在CONV-R脑组织中均升高（图7a）。结果表明， 共生微生物群可直接或间接地在哺乳动物中枢神经系统内大量介导氧化还原稳态、能量代谢以及神经元信号传导。

为了进一步围绕肠脑轴进行研究，研究人员比较了多个矩阵进行综合分析，如图7b所示。研究人员注意到，注意到在加热的ESI-分析模式下，在保留4.9分钟时，CONV-R 小鼠的离子特征m/z 212.002显著升高，而在GF小鼠中几乎不存在，其中血清（4,351.6倍）和脑组织（26.8倍）的变化最大（图7b）。在生物信息学组成分析中，确定该离子特征的元素组成为C ₈ H ₆ NO ₄ S （ [M-H]- ），根据该元素，中性结构被取消复制并确认为硫酸吲哚氧基（图7c）。硫酸吲哚氧基是一种已知的尿毒症毒素和心脏毒素，来源于宿主菌群对饮食色氨酸的代谢。研究人员的结果表明 ，微生物群衍生的硫酸吲哚氧基可能穿过BBB（血脑屏障）到达CNS ，这与两项新兴研究一致。与吲哚硫酸酯类似，吲哚硫酸酯具有微生物相关性，并具有跨隔式矩阵的共同趋势，研究人员还注意到在CONV-R小鼠中富集的另外两种芳香族氨基酸衍生物吲哚-3-乳酸和PAG。本研究中指出的其他潜在体液途径在CONV-R小鼠中的例子是， 三种基质中TMAO、蛋氨酸、维生素B5水平升高，血清和脑组织中尿囊素和皮质酮水平降低 （图7b；补充数据1-4）。

图7 微生物神经活性电位代谢物：大脑皮质、粪便和血清代谢组的综合分析。a 在随机森林模型中，前50种脑代谢物（y轴）根据基尼系数的平均降低精度（x轴）的贡献排列的变量重要性图（y轴），用于识别组间差异；嵌入的是大脑皮层脑组织中由于微生物群而改变的全部58种代谢物的MetaMapp网络视图，节点代表单个代谢物，边缘代表生化（京都基因和基因组百科全书，即KEGG反应物对）和化学（Tanimoto系数 > 0.7）的关系和较低的透明度，较低的 p 值（< 0.05，双边Welch’s t检验）。b 所选代谢物的箱形图显示了微生物群介导的粪便、血清和大脑皮层脑组织的系统性改变，箱线图显示中位数、25th和75th百分位数，延长线表示最小值和最大值（n = 24），* p   < 0.05，** p  < 0.01，***  p   < 0.001，**** p < 0.0001，双边Welch’s t检验；补充数据4中提供了精确的 p 值和校正后的 p 值（即 q 值）。c 与GF小鼠相比，在4.9分钟的保留时间内，离子特征 m/z  212.002的结构注释为吲哚硫酸酯，其在CONV-R血清（4351.6倍）和大脑皮质（26.8倍）中高度富集。

6 宿主生物化学的微生物重组具有性别特异性特征

在宿主-微生物群的相互作用中，性别二态型越来越多地被发现。在本研究中，为了根据体液肠-脑轴评估微生物群代谢组特征的性别特异性，研究人员重新查阅了对齐的特征表，并对所有离子特征进行了双向方差分析（ANOVA），同时考虑了微生物群（GF/COVN-R）和性别（雄性/雌性）的变量。在微生物群主效应显著的特征中，相当大比例的粪便中也表现出微生物群×性别相互作用（63.0%中的32.6%，即51.7%，HESI+），而血清中的比例较低（36.5%，HESI+），皮质脑中的比例最低（10%，HESI+）（校正 p  < 0.05）（图8a）； 为了进行更全面的检查，已确定性别对所有三种基质中的许多特征的主要影响，其中粪便特征与微生物群×性别相互作用的比例最大（82.8%，HESI+），而血清的比例较小（51.3%，HESI+），脑组织的比例最小（11.0%，HESI+） （图8b）。按性别分组数据，进行事后Tukey’s有效显著性差异（HSD）检验，比较GF和CONV-R（校正 p   < 0.05），以检查微生物群显著主要效应的个体特征是否表现出性别特异性（即仅在雄性或雌性中存在GF/CONV-R差异），性别差异分布总结在维恩图（附图4）和饼状图（图8c-e）。同时，研究人员重新查看了注释表，以检查改变的代谢物的性别特异性，得出了PieDonut分布（图8f-h），在性别特异性分子标记的比例方面，与离子特征饼图（即粪便 < 血清 ≈ 大脑）具有一致的趋势。除了GF/ CONV-R比较外，为了更全面的检查，研究人员还对GF/ CONV-R分组数据进行了Tukey’s HSD检验，分别对雄性和雌性进行比较，离子特征分布总结为维恩图和饼图（附图5）。

为了检验性别特异性的生化细节，研究人员依据GF/ CONV-R差异的性别特异性代谢物生成MetaMapp网络图（附图6-8）和MSEA图（附图9）（补充数据11）。研究人员注意到 粪便代谢组中的氨基酸、寡肽、氧化脂质、胆汁酸和碱基仅在雄性（67种化合物）或雌性（60种化合物）中发生改变 （补充图6）。与GF雄性相比，色氨酸分解代谢产物犬尿氨酸盐、黄脲酸盐、吲哚-3-甲醛和4-（2-氨基苯基）-2,4-二氧丁酸盐仅在雄性CONV-R粪便中升高（附图6a）。已知的微生物产品也表现出对性别的选择性改变，如癸二酸酯和己二酸酯仅用于雄性粪便（附图6a）和2,3-丁二酮，一种与健康状况相关的已知细菌毒素，如炎症性肠病、囊性纤维病，非酒精性脂肪肝，当存在微生物群时，仅在雌性粪便代谢组中富集（附图6b）。对于血清，研究人员观察到一系列脂质、有机酸和氨基酸表现出性别特异性（附图7）。具体而言，对于雄性血清，GF和CONV-R之间的多个酰基肌醇有不同的水平（附图7a），而雌性血清涉及一系列磷脂、氧化脂质和长链脂肪酸，它们在CONV-R中的含量均低于GF（附图7b）。研究人员还注意到几种芳香族氨基酸衍生物在雌性动物中选择性改变，但在雄性动物中没有，包括色氨酸分解代谢产物（例如，吲哚-3-甲醛、吲哚-3-乳酸）和阿魏酸盐（一种神经保护剂）。至于皮质脑中的代谢物，研究人员发现雄性小鼠中13种代谢物发生特异性改变，雌性小鼠中9种代谢物发生特异性改变，多种化合物参与氧化还原稳态和能量代谢（附图8）。值得注意的是， 前列腺素（B2和E2）、GSH、AKG和烟酰胺仅在雄性大脑皮层发生改变 （附图8a），而SAH、吲哚-3-乳酸、己酸、2-羟基丁酸和二十碳五烯酸（EPA）仅在雌性大脑皮层发生改变（附图8b）。综上所述，微生物群-脑轴表现出性别特异性特征，需要在未来研究微生物群在给定病理表型中的功能作用时加以解决。

图8 宿主代谢和肠道-脑轴的微生物重组表现出性别特异性特征。a通过双向方差分析（ANOVA）确定的具有显著微生物群主效应的离子特征比例（校正 p  <0.05）。b通过双向方差分析确定具有显著性别主效应的离子特征比例（校正 p   < 0.05）。c–e的性别分布饼图中离子特性在粪便（c）、血清（d）和大脑皮层（e）结合了HESI阳性和阴性模式，具有微生物群的主要影响（双向方差分析，校正 p   < 0.05），但至少有一种性别的GF/CONV-R存在统计学差异（经校正的Tukey’s HSD试验， p   < 0.05）。f–h粪便（f）、血清（g）和大脑皮层（h）中所确定化合物的性别特异性分布的PieDonut图，通过双向方差分析（校正 p  < 0.05）和校正的Tukey’s HSD试验（校正 p   < 0.05）确定。

讨论

最近的数据支持共生微生物群调节哺乳动物的大脑功能，开启了神经保护机制的靶向微生物群大门。然而，从肠-脑轴的角度来看，这种微生物效应的生化基础仍不清楚。代谢组学可以解决这一问题，但由于参考文献和工具（如商用化学标准和质谱数据库）有限，化合物识别率往往较低。为了扩大代谢组学的覆盖范围，对精确质量测量和化学信息工具的升级显示，有希望通过集成和验证的程序实现元素组成、分子结构和色谱保留时间的高通量电子预测。有鉴于此， 研究人员试图应用一套完整的化学信息规则和工具（非靶向注释程序），同时使用基于数百个参考化学标准的内部库（靶向注释程序），对“微生物-肠道-脑轴”的生化景观进行高覆盖制图。 采集8周龄的GF和CONV-R C57BL/6小鼠的粪便物质、血清和大脑皮质脑组织，提取并以高分辨率LC-HESI-HRMS分析。利用统计学和化学信息学，研究人员结合HESI模式筛选了20,939种不同的离子特征，并鉴定了数百种改变的代谢物，包括533种粪便代谢物，231种血清代谢物，58种脑组织代谢物。这些数据集代表了 微生物对宿主生物化学影响的第一个高覆盖代谢组特征，即机体间转运和肠-脑联系的体液途径。

通过化学和途径富集分析，研究人员获得了这些微生物介导的生化变化的“景观”视图。对于数万亿微生物居住的肠腔中的代谢以及持续的宿主-微生物群相互作用发生和汇聚，共有70个化学类簇和71条途径受到显著干扰，由14条氨基酸途径（特别是芳香族氨基酸）、嘌呤、胆汁酸、卟啉、维生素（如B和K）表示，多胺以及大量蛋白质分解代谢（超过100个寡肽发生改变）和能量收获事件（如TCA循环、酰基鸟嘌呤穿梭）。根据以往的研究，粪便芳香氨基酸，特别是色氨酸和酪氨酸代谢，在随机森林分类的50个排名靠前的代谢物成员中脱颖而出，具有很高的统计学意义。研究人员提供了粪便芳香氨基酸变化的综合观点，并观察了微生物宿主小鼠 （i）色氨酸途径通量增强，色氨酸减少，吲哚、血清素、黄嘌呤酸盐和狼嘌呤酸盐富集，（ii）莽草酸途径降低，而分支酸盐衍生物水平增加，（iii）抑制叶酸生物合成，（iv）丰富酪氨酸和下游副产物，包括儿茶酚胺神经递质 。重要的是，研究人员还发现超过30种改变的粪便胆汁酸，其中游离胆汁酸（原发和继发）明显升高，而结合的原发胆汁酸在微生物群存在时显著降低，包括那些与神经退行性疾病预后相关的胆汁酸，如阿尔茨海默病。

微生物对血液循环的系统影响表现为27类231种代谢产物的改变和61种代谢途径的显著影响，包括卟啉代谢、酮体、胆汁酸生物合成和一系列氨基酸等。需要注意的是，许多血清通路在肠道中也受到了干扰，后者通常在给定通路中包含大量改变的代谢物，同时需要注意的是特异性细节。例如，与肠道变化类似，携带微生物群的小鼠表现出不同的血清芳香氨基酸，其特征是 （i）富含微生物群衍生的吲哚 ，如吲哚硫酸酯和IPA（孕烷X受体的重要配体）， （ii）莽草酸途径改变，莽草酸-3-磷酸和奎宁酸水平降低，（iii）富含酚类代谢物苯乳酸、马尿酸、水杨酸和硫酸苯酯，而在肠道中观察到的酪氨酸和相关儿茶酚胺产物没有差异。 值得注意的是，哺乳动物细胞缺乏但与微生物密切相关的莽草酸途径被检测到受到微生物群的干扰，从而影响其他芳香族氨基酸和相关神经递质的生成（例如，血清素、酪胺）。这表明 需要评估莽草酸微生物群宿主网络和相关的健康风险 ，例如，使用莽草酸途径抑制神经毒性除草剂（如草甘膦），长期以来认为对哺乳动物无害。例如，在分子水平上，随机森林分类将4-乙基苯酚（酪氨酸的微生物代谢物和微生物4-乙基苯基硫酸盐的前体）列为CONV-R/GF组分离的顶级代谢物变量。综上所述，这些微生物群驱动的系统性变化与肠道代谢变化相耦合，可作为未来研究探索微生物对宿主生理和健康影响的有价值参考，从而保证进一步阐明相关基因、酶和转运蛋白以及特定微生物成员的作用。

研究人员应用了高覆盖代谢组学，通过微生物群搜索大脑特征（附图1）。针对大脑皮层区域，研究人员试图找到微生物群大脑网络原理的证据。总共鉴定出58个改变的脑代谢物，包括蛋氨酸/谷胱甘肽代谢物、二十烷类前列腺素、酮体、微生物衍生代谢物，如丁酸、吲哚酰硫酸盐、TMAO、莽草酸/苯丙氨酸衍生物羟基苯基乳酸和PAG。总的来说，结果与最近出现的研究一致， 具有特定的代谢物（如2-羟基丁酸酯、TMAO、谷胱甘肽和乙酰神经氨酸）和途径（如氧化应激、反硫化），同时与涉及短链脂肪酸、微生物相关分子模式的其他研究互补 （例如，脂多糖） 和酚 。研究人员的新数据支持微生物群控制中枢神经系统的生理状况，特别是在转硫、氧化还原稳态和神经炎症方面。

微生物组学领域的一个中心主题是根据肠-脑信号探讨高丰度微生物组的神经调节活动，因为它们具有产生神经递质的巨大能力，并且与许多精神和/或神经疾病结果相关，如抑郁症、自闭症谱系障碍、阿尔茨海默病，还有帕金森病。然而，到目前为止，只有少数分子线索揭示了这种微生物群-脑轴的潜在作用，其机制基本上还不清楚。研究人员的高覆盖率方法结合了靶向和非靶向的注释过程，使研究人员能够解决这一问题；样本基质中GF/CONV-R差异的代谢组具有共同或相反的趋势，表明存在直接或间接体液途径的可能性，有关肠道微生物代谢物的组织间转运及其对BBB通透性影响的部分研究支持了这一点。

研究人员发现肠道微生物群是胃肠道神经递质产生的主要调节因子，例如： （i）大量消耗超过15种无微生物群的“经典”神经递质，（ii）儿茶酚胺生物合成和谷氨酰胺/谷氨酸GABA代谢变化的整合图，以及（iii）所示色氨酸途径衍生的神经递质（如血清素、犬尿氨酸） 。此外，研究人员还发现微生物群对其转化的广泛控制，特别是通过去结合。该结果很好地补充了最近确认肠道细菌是神经递质产生者的研究，同时支持了局部肠道微生物从其结合形式（如葡萄糖醛酸苷、硫酸盐）中重新激活II期代谢物的能力，可能通过水解酶，如β-葡萄糖醛酸酶（GUSs）和/或β-葡萄糖苷酶。有趣的是，除组胺、甘氨酸、己二酸氨基酯和皮质醇外，大多数具有不同粪便模式的神经递质在血清代谢组中要么未检测到，要么未表现出统计差异，要么表现出相反的趋势（如GABA、组胺）；值得注意的是，雄性CONV-R小鼠的血清5-羟色胺水平显著升高（与雄性GF相比），但雌性组之间没有显著差异。这些共同表明，尽管肠道中的微生物神经递质网络具有巨大的代谢活性，但这些微生物源性神经递质的体液转运和/或系统效应在肠道中相对有限，并且可能受到性别的影响。这种严格的器官划分和微生物神经递质的性别特异性特征需要在未来进行研究。尽管如此，研究人员还是发现了一系列可能参与组织间转运和肠脑沟通的化合物，其中微生物群的存在导致从肠道和/或血液到大脑皮层的水平激增。这些物质包括吲哚（例如，吲哚硫酸酯、吲哚-3-乳酸）、酚类物质（例如，4-乙基苯酚、硫酸苯酯、PAG）、胆碱衍生物（例如，TMAO）、维生素B（例如，泛酸盐）、丁酸盐和蛋氨酸，其中一些在GF小鼠中几乎不存在。值得注意的是， 已知的尿毒症毒素和氧化应激标记物吲哚酚硫酸盐（来源于肠道细菌吲哚酚）在存在微生物群的情况下，在循环血液（4351.6倍）和脑组织（26.8倍）中的升高变化最高。 同样，TMAO在血清（267.3倍）和大脑（7.32倍）中的最高倍数变化排名第三，同时由于微生物群的存在，肠腔水平升高（5.90倍）。TMAO也是一种尿毒症毒素和氧化应激标记物，是肠道细菌三甲胺通过宿主肝黄素单加氧酶的氧化产物，在心血管疾病中表现出不良影响。相反，当存在微生物群时，泛酸和长双歧杆菌产品吲哚-3-乳酸等抗氧化剂在血清和大脑中也显著升高。总之，这些发现支持了共生微生物群可以通过直接体液途径介导CNS（尤其是氧化还原稳态和神经炎症）的概念，但其作用可能因多种因素而不同，如特定微生物群组成及其代谢产物，以及性别、年龄、年龄、性别和性别，以及哺乳动物宿主的健康状况。

这项研究的优势在于使用无菌小鼠模型、灵敏和高覆盖率的代谢组学方法，以及一套统计和可视化工具，这些工具允许完整地分析和挖掘微生物群特异性分子特征，以及微生物群-肠-脑解释的多重比较。 本研究的注意事项和局限性包括：（i）代谢组学结果本质上是描述性的，需要通过粪便移植实验和特定途径的稳定同位素示踪辅助通量分析等来测试体液-组织间联系的特定假设；（ii）本研究中观察到的代谢组学变化应被视为宿主微生物群相互作用的分子表型表征，而不是单独的微生物效应；（iii）使用峰面积进行统计，而不是绝对摩尔浓度，这对于推断给定器官基质的实际代谢活动至关重要；（iv）在本研究中，通过准确的质量MS/MS分析和机器学习预测的保留时间确认的2级注释可能仍然不符合明确的立体异构体分配；（v）生物化学途径被广泛地解释，并且主要是从还原论的角度来解释的，因此有必要进行研究，以进一步在细菌和/或途径特异性水平上进行描述，并调查看似不同的化学类别之间的相互作用。 总之，研究人员提出了一种 高覆盖率代谢组学 方法，用于根据小鼠体内的组织间转运和肠-脑联系来表征微生物群对宿主代谢组的影响；这项研究的新发现和见解可能对未来的微生物组学研究有价值。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-021-26209-8

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