英文原题：Unveiling the Crucial Roles of O₂
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and ATP in Hepatic Ischemia–Reperfusion Injury Using Dual-Color/Reversible Fluorescence Imaging
通讯作者：
张雯，山东师范大学；吴庐陵，巴斯大学；Tony D. James，巴斯大学；李平，山东师范大学；唐波，山东师范大学
作者：
Jihong Liu, Wen Zhang*, Xin Wang, Qi Ding, Chuanchen Wu, Wei Zhang, Luling Wu*, Tony D. James*, Ping Li*, and Bo Tang*
肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是肝脏切除手术和肝脏移植手术中不可避免的并发症，是术后肝功能障碍和肝功能衰竭的主要原因。在HIRI发展进程中，加剧的氧化应激与受损的能量代谢协同作用，共同在肝损伤中发挥重要作用。超氧阴离子（O₂
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）和三磷酸腺苷（ATP）分别为氧化应激和能量代谢相关的关键生物标志物。然而，由于缺乏合适的原位成像工具，O₂
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和ATP在HIRI中的时空波动以及它们如何协同参与HIRI的病理机制目前尚不清楚。现有的O₂
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或ATP响应型荧光探针由于其不可逆机制，不适合动态监测HIRI过程中O₂
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和ATP的水平变化。因此，迫切需要开发一种荧光探针，能够在HIRI过程中同时、可逆地检测O₂
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和ATP，这不仅能够监控HIRI过程中O₂
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和ATP的时空、动态变化，而且有望揭示O₂
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和ATP在HIRI中的相关性及调控机制。
基于以上背景，
山东师范大学唐波教授/李平教授课题组
发展了一种双色双可逆分子荧光探针(UDP)用于HIRI过程中O₂
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和ATP的实时、动态和同步可视化，并揭示了它们在HIRI中的相互关系和协同作用。该成果以“Unveiling the Crucial Roles of O₂
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and ATP in Hepatic Ischemia−Reperfusion Injury Using Dual-Color/Reversible Fluorescence Imaging”为题发表在国际权威杂志
Journal of the American Chemical Society
上。该项研究工作也是唐波教授/李平教授课题组于2022年在
Journal of the American Chemical Society
（
J. Am. Chem. Soc.
, 2022, 144, 1, 174–183;
J. Am. Chem. Soc.,
2022, 144, 30, 13586–13599）上发表关于药物诱导的肝损伤ONOO⁻和ATP的单/双光子成像与NIR-Ⅱ荧光引导HIRI的精准导航工作之后，在肝损伤研究方面取得的又一个突破性研究结果。文章第一作者是山东师范大学博士研究生刘继红，山东师范大学张雯副教授、巴斯大学吴庐陵博士、Tony D. James教授、山东师范大学李平教授和唐波教授为论文共同通讯作者。
本文中，作者报道了一种兼具双色和双可逆性质的荧光探针（UDP），UDP对O₂
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和ATP的响应具有优异的灵敏度、选择性和可逆性，这使得UDP能够在蓝色和红色荧光通道中独立响应O₂
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和ATP水平变化，没有光谱串扰。UDP在HIRI过程中的原位成像首次揭示了肝细胞和小鼠肝脏的同步O₂
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爆发和ATP消耗。作者揭示了HIRI过程中细胞内的O₂
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—琥珀酸脱氢酶（SDH）—线粒体内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路，首次阐明了O₂
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和ATP在HIRI过程中的关联性。这项工作证实了UDP在动态监测HIRI和揭示HIRI发病机理的巨大潜能。
图1 UDP的结构和荧光性质。
（A）UDP响应O₂
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和ATP的可逆发光机制。为了构建O₂
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和ATP双可逆响应的荧光探针，咖啡酸与罗丹明B分别作为O₂
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和ATP特异性的识别基团和相应的荧光团，二者通过二乙烯三胺连接。作为常用的O₂
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清除剂，咖啡酸被用作O₂
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高特异性的识别基团，O₂
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特异性氧化咖啡酸中的对苯二酚基团生成苯醌，从而促进蓝色荧光的产生。修饰二乙烯三胺的罗丹明螺内酰胺衍生物由于具有多个氨基，已被证明是ATP高灵敏和选择性的响应位点。咖啡酸基团与O₂
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的反应过程和罗丹明螺内酰胺部分与ATP的结合作用均具有可逆性，有望动态追踪O₂
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和ATP水平变化。（B）UDP响应不同浓度O₂
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的荧光光谱。（C）UDP在470 nm处的荧光强度与O₂
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水平的关系。（D）UDP的O₂
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通道对常见干扰物质的选择性。（E）UDP响应不同浓度ATP的荧光光谱。（F）UDP在588 nm处的荧光强度与ATP水平的关系。（G）UDP的ATP通道对常见干扰物质的选择性。
图2 UDP的可逆性、光谱串扰和生物毒性评价。
（A）添加O₂
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(65 μM)和GSH(200 μM)后，UDP蓝色荧光的可逆响应循环。（B）在22 mM ATP存在下，加入不同浓度的O₂
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(0-65 μM)后，UDP在O₂
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通道的荧光光谱。（C）与65 μM O₂
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和22 mM ATP反应前后UDP的吸收光谱。（D）添加ATP(22 mM)和三磷酸腺苷双磷酸酶(1 U/N)后，UDP红色荧光的可逆响应循环。（E）在65 μM O₂
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存在下，加入不同浓度的ATP(0-22 mM)后，UDP在ATP通道的荧光光谱。（F）UDP的生物毒性评估。
图3 2-甲基雌二醇（2-ME）或寡霉素A（Omy A）刺激肝细胞中O₂
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和ATP波动的共聚焦荧光成像。
（A）2-ME（O₂
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刺激剂）和钛铁试剂（O₂
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清除剂）处理的肝细胞O₂
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（蓝色通道，λ
ex
= 405 nm, λ
em
= 420-490 nm）和ATP（红色通道，λ
ex
= 514 nm, λ
em
= 525-668 nm）的共聚焦荧光成像。（B）Omy A（ATP抑制剂）和ATP处理的肝细胞O₂
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和ATP的共聚焦荧光成像。(C, D)分别为(A, B)的相对蓝色和红色荧光强度输出。
图4 HIRI全过程中肝细胞O₂
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和ATP波动的动态可视化及HIRI药物NAC的干预效果。
（A）缺血0分钟、20分钟、40分钟，缺血40分钟后再灌注20分钟、缺血40分钟后再灌注40分钟以及0.5 mM、1 mM NAC预处理组肝细胞对O₂
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(蓝色通道，λ
ex
= 405 nm， λ
em
= 420-490 nm)和ATP(红色通道，λ
ex
= 514 nm， λ
em
= 525-668 nm)进行荧光成像。(B, C) A图的相对蓝色和红色荧光强度输出。(D) ROS含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的相对ROS水平。(E) ATP含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的ATP水平。
图5 HIRI期间小鼠肝脏中O₂
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和ATP动态的实时可视化。
(A)操作示意图。(B)缺血0分钟、缺血20分钟、缺血40分钟及缺血40分钟再灌注20分钟、缺血40分钟再灌注40分钟小鼠肝脏中O₂
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(蓝色通道，λ
ex
= 405 nm， λ
em
= 420-490 nm)和ATP(红色通道，λ
ex
= 514 nm， λ
em
= 525-668 nm)的荧光成像。(C, D) B图的相对蓝色和红色荧光强度输出。
图6 通过LC-MS/MS分析琥珀酸脱氢酶与O₂
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反应的蛋白质组学。
(A) C68, M71的氧化。(B) W47的氧化。(C) H57的氧化。(D) W218的氧化。*和红色表示的残基代表O₂
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的修饰位点。
图7 HIRI过程中细胞内的O₂
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—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。
（A）经不同处理的肝细胞的SDH活性分析。（B-C）经不同处理的肝细胞线粒体NADH含量。（D）经不同处理的肝细胞线粒体ATP含量。（E）在3-NPA作用下，使用UDP荧光成像肝细胞ATP。(F) E图的相对红色荧光强度输出。（G）经不同处理的肝细胞细胞ATP含量。（H）HIRI过程中细胞内的O₂
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—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。
本文成功开发了一个对O₂
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和ATP具有高灵敏度和卓越选择性响应的双色双可逆的分子平台（UDP）。UDP能够同时、可逆响应O₂
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和ATP，并且独立监控蓝色和红色通道内的荧光，而不受光谱串扰的影响。得益于探针在体外响应O₂
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和ATP出色的性能，UDP成功被用于同时成像与动态监测肝细胞内源性的O₂
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和ATP水平。通过分离良好的蓝、红光，UDP进一步被用来实时、原位可视化HIRI全过程中肝细胞内O₂
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和ATP及HIRI药物的干预效果。更重要的是，UDP成功实现了HIRI过程中小鼠肝脏内O₂
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和ATP的可视化。最后，本文首次揭示了HIRI过程中细胞内的O₂
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—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联介导的信号通路。这项工作报道了首个研究HIRI中O₂
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和ATP之间相关性和协同作用的荧光探针，有望为深入了解HIRI进展中相互联系的活性分子之间的相互作用提供多种机会。
张雯，分析化学专业博士，山东师范大学副教授，硕士生导师。2015年进入山东师范大学化学化工与材料科学学院。主要从事功能小分子荧光探针的设计合成，并探索其在生物传感与成像领域的应用研究。以第一或通讯作者身份在
J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed.，Chem. Sci.，Anal. Chem.，Chem. Commun.
等国际重要的学术刊物上面发表论文10余篇。
吴庐陵博士，英国巴斯大学（右）；Tony D. James教授，英国巴斯大学（左）
吴庐陵，英国巴斯大学博士。博士由国家留学基金委和英国巴斯大学共同资助。2022年至2023年在西湖大学进行博士后研究，期间获得博士后国际交流计划引进项目。2023年在巴斯大学从事由英国工程与自然科学研究理事会（EPSRC）资助的博士后研究。主要研究方向是基于多种逻辑与双重响应策略，发展针对多种目标物的同时成像分析方法；开发基于无苯环荧光团（薁）的探针。目前以第一或共同通讯作者在
J. Am. Chem. Soc.、Nat. Rev. Chem.
等杂志发表论文26篇。参编英文专著一本，并撰写其中一个章节。担任
JACS Au, Chem. Rev., Chem. Sci.
等期刊的审稿人，以及
Biosensors
期刊的客座编辑。
Tony D. James教授，英国巴斯大学化学系教授，英国皇家化学学会会员。1986年于英国东安格利亚大学获得学士学位，1991年于加拿大维多利亚大学获得博士学位，1991到1995年期间于日本Shinkai教授课题组做博士后，1995到2000年期间于英国伯明翰大学任皇家学会研究员。2013年因对日本和英国科研合作做出的杰出贡献获得了达亿瓦-艾德里安奖。长期从事分子识别，分子组装，荧光探针方面的研究，是糖识别及超分子化学方向的国际知名专家。Tony D. James教授已出版三本专著，在
Nature, Nat. Chem., Chem. Rev., Chem. Soc. Rev., JACS
和
Angew. Chem. Int. Ed.
等国际学术期刊上发表443余篇学术论文，此外拥有25项国际专利。
https://researchportal.bath.ac.uk/en/persons/tony-james
李平，山东师范大学二级教授、博士生导师，享受国务院政府特殊津贴、入选百千万人才工程国家级人选、国家有突出贡献中青年专家、泰山学者、教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队带头人、教育部“全国高校黄大年式教师团队”骨干成员、山东省有突出贡献的中青年专家、山东省优秀研究生导学团队负责人、山东省高校重点实验室首席专家、山东生物医学工程学会专业委员会委员、山东省科协国家级科技思想库决策咨询专家、
AIMS Materials Science
编委、中国致公党山东师范大学基层委员会副主委。李平教授多年来致力于新型光学功能探针的构建，以及细胞与活体内生物活性分子化学成像的研究工作，取得了一系列重要突破和研究进展。已主持完成国家重点基础研究发展计划（“973计划”）课题1项、国家自然科学基金面上项目3项、国家重大新药创制课题子课题1项、国家自然科学基金青年基金1项、山东省自然科学基金重大基础研究项目1项及山东省科技攻关项目1项。目前主持国家自然科学基金面上项目1项。相关研究成果已在
Chem. Soc. Rev.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem. Sci.、Anal. Chem.、Chem. Commun.
等国际重要的学术刊物上面发表论文80余篇，其中影响因子5.0以上70余篇，10.0以上20余篇，论文总引用达3000余次。作为主要参与者完成的项目，先后荣获国家自然科学二等奖（3/5）、国家科技进步二等奖（8/10），山东省自然科学一等奖（2/4）、山东省自然科学二等奖（1/4）、山东省科技进步一等奖（5/8）、山东省青年科技奖以及山东高等学校优秀科研成果二等奖（1/3）等。此外，李平教授还曾获山东省教育系统女职工建功立业标兵、齐鲁最美教师——山东省教书育人楷模、山东省省级教学成果奖一等奖（9/10）、山东师大研究生教育教学成果奖一等奖（9/10）、山东师大优秀教学奖及“青年教学能手”等荣誉称号。
http://www.lipinglab.com/
唐波，汉族，1964年11月生，中共党员，1994年毕业于南开大学化学系，获理学博士，化学化工与材料科学学院教授、博士生导师，南开大学兼职教授，山东大学兼职博士生导师，教育部科技委学部委员，首届十佳全国优秀科技工作者提名奖获得者（山东省唯一），973计划首席科学家，国家杰出青年科学基金获得者，“新世纪百千万人才工程”国家级人选，入选“泰山学者攀登计划”，是国家自然科学基金委员会第12、13届专家组成员，农药、医药中间体清洁生产教育部工程研究中心主任，“分子与纳米探针”教育部重点实验室主任，山东省“十二五”分析化学特色强化重点学科负责人，山东省“十二五”高等学校强化建设太阳能化学转化与储存重点实验室学术带头人，山东省精细化学品清洁合成重点实验室学术带头人；山东师范大学省级化学学科带头人、分析化学学科带头人，化学博士学位授权一级学科负责人，化学博士后科研流动站负责人，他所领导的团队是教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队和山东省优秀创新团队。现主要从事分子及纳米荧光探针的合成及其在生物成像中的应用、绿色化工、荧光材料合成及太阳能化学转化与储存等方面研究工作。在理论研究领域，在
Nat. Commun., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nano Lett., ACS Nano, Adv. Funct. Mater., Anal. Chem., Biomaterials, Lab Chip, Chem. Commun.
等杂志发表SCI论文500余篇，影响因子大于5.0的300余篇，引用达20000余次，荣获国家自然科学二等奖1项，山东省自然科学奖一等奖1项。在应用研究方面，申请国家发明专利44项，已授权31项；荣获国家科技进步奖二等奖2项，山东省科技进步奖一等奖2项、技术发明奖一等奖1项。在国内建立高新技术产业化基地与合作基地6个，研制与开发产品40余种，取得了显著的经济效益与社会效益。唐波的研究成果引起了国内外的广泛关注，多次参加国内外学术会议，进行学术交流。主持国家重点基础研究发展计划（973）、国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金科学仪器基础研究专项等多项国家级项目。
http://www.tangb.sdnu.edu.cn/index.htm
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J. Am. Chem. Soc.
2023, ASAP
Publication Date: Publication Date: September 1, 2023
https://doi.org/10.1021/jacs.3c04303
Copyright © 2022 The Authors. Published by American Chemical Society. This publication is licensed under CC-BY 4.0.
主编
：
Erick Carreira（
ETH Zürich
）
JACS
was founded in 1879. It is the flagship journal of the American Chemical Society and the world’s preeminent journal in all of chemistry and interfacing areas of science. This periodical is devoted to the publication of fundamental research papers and publishes approximately 19,000 pages of Articles, Communications, and Perspectives a year.
